細胞內單域抗體的研究及應用進展

潘永剛，劉曉志，高 健，王志明

0 引言

在蛋白質功能研究中，DNA敲除和mRNA敲低方法是必不可少的研究手段。蛋白質抑制劑是蛋白質翻譯后修飾、構象和相互作用區域研究的有益補充[1]。蛋白質抑制劑包括肽、變構調節劑、短單鏈DNA或RNA寡核苷酸(Aptamers，Intramers)、中和抗體、胞內抗體和非免疫球蛋白支架抗體(如：cysteine-Knot Proteins、Adnectins、Anticalins、Affibodies和DARPins等)。

細胞內抗體，即靶向細胞內抗原的抗體分子，是重組的抗體片段，主要優點是特異性高，靶向翻譯后修飾，相互作用區域，構象異構體，剪接變體和同種型，沒有脫靶效應。不同于經典的中和抗體，細胞內抗體可以實現對細胞內蛋白質功能的長效抑制，可以被特異性地轉運到細胞質，細胞核或內質網的特定區域，并與相應的抗原結合[2]。

細胞內抗體發展的問題：scFv和Fab型的細胞內抗體不能在細胞質的還原環境內形成二硫鍵，因此，其結構穩定性差。

酵母雙雜交系統中表達的功能性scFv型細胞內抗體的研究策略，使一些功能性scFv型的胞內抗體被發現[3]。在抗體工程研究中，研究者發現了穩定型的sdAb(Single domain antibody)型細胞內抗體，這些抗體來自駱駝或鯊魚，但是僅包含抗體的重鏈可變區。VHH是來自駱駝的重鏈抗體，識別新抗原受體(IgNAR，New antigen receptor)的抗體來自鯊魚的可變區，稱為vNAR。來自駱駝的VHH稱為納米抗體(Nanobodies)。

來自駱駝或鯊魚的單域抗體均具有完整的功能性抗原結合位點，VHH單域抗體具有3個互補決定的CDR (Complementarity determining regions)區，vNAR單域抗體包括CDR1、CDR3、HV2和HV4。駱駝和鯊魚的單域抗體具有良好的溶解性、熱穩定性和復性能力。此外，通過構架區的突變和CDRs隨機改造，可以增加人源VH和VL單域抗體的穩定性。即使沒有形成二硫鍵，駱駝源抗體也可以在細胞質中穩定表達。折疊后的納米抗體可以找到抗原，并和抗原穩定結合[4]。

納米抗體被用于體內分子運輸過程、蛋白質構象檢測和翻譯后修飾的研究。此外，當不穩定蛋白質對降解、展開或聚集敏感時，納米抗體也作為結晶分子伴侶使用。

抗體片段一般通過噬菌體或酵母進行展示，然后通過篩選sdAbs抗體、單克隆化等步驟，最終得到細胞內抗體。通用合成抗體庫進行納米抗體的篩選不需要用抗原進行動物免疫，因此較為快捷。低親和力抗體可以通過CDR突變、熱點隨機化突變或容錯PCR實現親和力成熟。目前，納米抗體數目不斷增長，其中大多數來源于駱駝，一些來源于人源VH和VL的結構域。此類靶點包括：包括激酶的胞內酶、致癌蛋白、毒素、神經系統的蛋白質、病毒蛋白、植物和果蠅蛋白等[5]。

大多數sdAbs已經在活細胞中進行了評估，其中一部分進行了動物實驗。在一些研究中，基因敲除對實驗動物是致命的，而使用表達細胞內sdAb轉基因小鼠可以進行替代。

ER (Endoplasmic reticulum，內質網)胞內抗體的功能敲除是通過胞內抗體C末端與KDEL序列結合，滯留分泌途徑上相關分子來實現[6]。ER-胞內抗體可以在ER環境中進行正確折疊[7]，因而曾被認為是最有希望的蛋白抑制劑。與ER-胞內抗原結合相反，胞內抗體必須通過與抗原結合并誘導構象改變，或干擾靶蛋白與其特異性結合伴侶分子，而實現蛋白功能的抑制。靶向ER(ER-胞內抗體)的內抗體主要是scFv片段，胞質/胞內抗體是scFv片段更穩定的單域抗體。由于sdAb在細胞質/細胞核中的高穩定性，基于噬菌體和酵母篩選的高特異性，對胞質/核蛋白功能抑制的sdAb具備良好的開發和研究前景。

1 細胞質/細胞核內抗體

為了獲得穩定正確折疊的scFv片段，必須使用酵母、大腸桿菌等系統進行特異性抗體的篩選，其他可能的選擇包括，表達scFv-蛋白融合CDR，或將合成的CDR引入穩定的抗體框架上[8]。基于酵母雙雜交系統的抗體捕獲技術(Antibody Capture Technology，IACT)是篩選功能性scFv的最常用的方法。

1.1 ScFv型抗體 IACT技術篩選得到了許多不同的scFv，如：針對Tau蛋白、淀粉樣蛋白-β肽、α-突觸核蛋白、proNGF、gephyrin、Syk、EGFR、BCR-ABL、半胱天冬酶3、聚集蛋白聚糖酶-2和輪狀病毒NSP5蛋白。

最近，研究者應用IACT技術篩選到針對HPV病毒 E6癌蛋白的scFv片段，該片段到達細胞核并抑制HPV16E6(16E6)活性，誘導p53降解，引發HPV16陽性細胞凋亡。此外，在2項小鼠實驗中，靶向細胞核的細胞內抗體抑制了HPV16陽性腫瘤細胞的腫瘤活性。另外，構建的2種雙特異性scFv片段，第1種同時具有靶向細胞核轉運和恢復突變p53功能，第2種同時具有靶向細胞核轉運和結合Mdm2，防止p53被Mdm2降解[9]。上述3種scFv片段均由相應雜交瘤克隆獲得。

1.2 單域抗體 與繁瑣耗時的scFv′s篩選不同，單域抗體可通過免疫、天然、合成文庫、有噬菌體或酵母展示技術進行快速抗體篩選。單域抗體僅由1個V區(重鏈或輕鏈可變區)組成，其可以在細胞質或細胞核內穩定表達。

2 細胞質/細胞核單域胞內抗體

從駱駝科重鏈IgG(VHHs)、軟骨魚IgNAR(VNA)或常規人IgG(VH和VL)可以獲得單域抗體。上述抗體可以由駱駝或鯊魚的免疫庫、天然庫或由具有穩定支架的合成庫中篩選得到。然而，針對免疫駱駝的操作較免疫鯊魚方便。因此，鯊魚單域抗體的篩選大多選自合成庫。人源VH或VL單域抗體一般從VH和VL合成抗體庫中進行篩選[10]。

2.1 駱駝VHH免疫文庫的構建和篩選 研究者通過對駱駝進行免疫，獲得駱駝VHHs的免疫文庫；采用結合IgG cDNA的N端和CH2區結合的引物，進行VHH的PCR擴增，再對VHH編碼區進行巢式PCR擴增。將PCR產物克隆到噬菌體載體中，建立噬菌體抗體庫[11]。

至今，大部分納米抗體和細胞質/細胞核納米抗體是從靶蛋白免疫美洲駝后獲得的免疫庫中篩選得到的。納米抗體抑制了HIV Rev，HIV Vpr，HIV-1 Nef，流感病毒核蛋白，乙肝核心抗原(Hepatitis B core antigen，HBcAg)，9種非結構蛋白，4種豬藍耳病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，豬內源性逆轉錄病毒基質蛋白，鼠傷寒沙門氏菌SpvB毒素，肉毒梭菌神經毒素蛋白酶，霉菌毒素15-乙酰喔科煙酰胺(15-Acetyldeoxynivalenol，15-AcDON)，蛋白激酶C，F-肌動蛋白 CapG，L-肌動蛋白，肌成束蛋白和cortactin，凝溶膠蛋白，β-鏈蛋白，2.5二羥基吡啶雙加氧酶(NicX)，β2-腎上腺素能受體，馬鈴薯Y病毒N1a蛋白酶和靶向GFP蛋白(消除真核生物GFP融合蛋白)等的蛋白質功能和活性[12-15]。

天然文庫和合成抗體文庫的優點是無需對動物進行免疫，缺點是篩選得到的抗體需要進行親和力成熟。然而，如果這些文庫含有大量高度多樣性的克隆，且這些克隆針對所有可能的靶點和表位，會增加篩選難度。通過1個克隆步驟，就可以將選定的sdAb轉化為胞質/核抗體片段[16]。

2.2 駱駝VHH天然文庫的構建和篩選 天然美洲駝VHH文庫可以來源于1只動物，為了增加文庫多樣性，也可以來源于多只動物的血液樣本。已構建的天然文庫克隆數目范圍為107～5×109個。最近納米抗體核糖體展示技術的發展，使得核糖體-VHH復合物可以在不同表達系統中進行表達。

有學者應用VHH文庫篩選得到了細胞質/細胞核的sdAb，針對細胞質/細胞核內的靶點蛋白包括：HCV的非結構性膜蛋白NSB4，Bax，HCV的NS3解旋酶，RNA依賴性RNA聚合酶NS5B，核多聚(A)- 結合蛋白1(PABPN1)和Caspase-3[17]。

2.3 合成VHH文庫的構建和篩選 研究者根據天然VHH框架構建了駱駝VHH合成文庫。通過CDR的隨機化(主要是CDR3)引入了抗原結合的多樣性。研究者利用3只未免疫的美洲駝，通過對CDR和框架進行易錯PCR，再利用PCR將這些序列與通用框架重疊拼接在一起，通過上述操作，完成了半合成文庫的構建。

有學者篩選得到了導致異源核內核糖核蛋白K(Heterogenous nuclear ribonucleoprotein K，hnRPN-K)積累的納米抗體。此外，篩選得到了明顯抑制馬鈴薯淀粉分支酶的酶活性的納米抗體[18]。最近，將抗GFP VHH的CDRs與抗-β內酰胺酶VHH的穩定框架結合，構建得到了一種非常穩定的抗GFP納米抗體，后者是成形素的一個組分，用于果蠅(Decapentaplegic，Dpp)的翼展發育研究。

2.4 人源VH/VL合成文庫的構建和篩選 人源VH/VL合成文庫是由穩定的人VH/VL種系構建或人單克隆抗體的VH/VL支架構建的。CDR的隨機化技術，尤其是針對CDR3的隨機化，使得人源VH/VL合成文庫具有更高的多樣性。最近構建的包含人神經細胞黏附分子1(Neural cell adhesion molecule 1，NCAM1)的Ig1結構域的合成文庫，整合了來自鯊魚克隆的隨機化CDR1和CDR3[19]。利用合成文庫篩選得到了阻斷趨化因子受體CXCR4信號傳導活性的嵌合抗體[20]。

有學者根據1個人VH合成文庫(利用抗RAS的scFv的VH框架)，篩選得到了抗myc的人VH單域抗體；應用酵母雙雜交系統進行CDR3、CDR2和CDR1的逐步隨機化，得到了抗myc的特異性抗體；同法篩選得到了抗RAS的人源VH和抗LIM結構域2(LIM domain only 2，LMO2)的人源VH。在小鼠腫瘤模型中，抗RAS 的人源VH抑制RAS依賴性的腫瘤發生，抗LMO2的人源VH抑制裸鼠中的T細胞瘤的形成；根據1個具有隨機CDR3的人Κ結構域框架的合成文庫，篩選得到了抗上皮激酶(Epithelial kinase，Etk)的VL。

此外，人源VH的駱駝源化，可以通過人源VH框架(主要是框架2)中引入點突變來實現，以使抗體結構更具親水性。此類駱駝化人源VH框架，已經用于產生CDR3隨機單結構庫的噬菌體展示系統中，用于改善產物的溶解度和重折疊效率。將兔源抗HIV Vif的VH單域細胞內抗體，與駱駝源的框架相結合，得到了一株有活性的抗體。

2.5 IgNAR可變區(vNAR)合成文庫的構建和篩選 vNAR文庫的構建，一般是將天然vNAR序列和隨機化CDR3環結合形成的半合成文庫中進行篩選。使用鯊魚抗雞蛋白溶菌酶的IgNAR VH克隆作為框架，結合隨機化CDR3環形成半合成文庫。最近研究顯示，根據2型鉸口鯊魚的VNAR框架，結合多個框架突變和部分隨機化的CDR3的鯊魚抗體庫，可篩選出可以阻斷BAFF與其全部3種受體結合，抗BAFF的中和vNAR單域抗體。目前，未見有關鯊魚細胞質/細胞核sdAb篩選的相關報道。

為了篩選特異性sdAb，將sdAb展示在噬菌體或酵母細胞的細胞表面上。將重組噬菌體抗體庫與固定抗原(生物淘選)一起溫育，將篩選得到的特異性結合物克隆到細胞質或細胞核的靶向載體中，得到的細胞質/細胞核胞內抗體，將在靶細胞、異種移植腫瘤小鼠模型或轉基因sdAb小鼠中進行評估。

最近，一種用于鑒定功能性sdAb的新的篩選方法正處于開發階段，該試驗采用滅活A型流感病毒(Inactivated influenza A virus，IAV)和水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)免疫羊駝。隨后將VHH的 cDNA直接克隆到逆轉錄病毒載體中，以產生慢病毒顆粒。然后，用重組病毒感染A549細胞，48 h后，用IAV和VSV的致死劑量進行處理。對存活菌落進行鑒定，確定VHH序列。篩選得到19種可以特異性阻斷IAV或VSV細胞感染的VHH抗體[21]。這種篩選方法適用于鑒定病原體或生物學途徑的抑制劑。

大多數sdAb篩選是通過噬菌體展示系統，而不使用細菌、酵母或哺乳動物雙雜交系統。這種方法可靠，可用于篩選細胞質/細胞核scFv片段和sdAb，因為這種篩選可以得到正確折疊的scFv片段或sdAb，而不是高親和力的scFv片段或sdAb。然而，抗體親和力是否是細胞內抗體有效的唯一先決條件尚不明確。細菌、酵母或哺乳動物雙雜交系統可以在不需要純化抗原的情況下，直接在細胞內篩選功能性細胞質/細胞核抗體。另一種雙雜交檢測技術，允許直接研究活細胞中2種蛋白質的相互作用。熒光標記的獵物蛋白和熒光標記lacI (lac操縱子抑制劑)融合的相應誘餌蛋白，在包含染色體整合的lac操縱子的哺乳動物細胞一起表達。兩個分子的相互作用，導致兩個不同的熒光信號在lac操縱子上共定位，并可在細胞核內觀察到。

3 細胞質/細胞核單域抗體的篩選

針對40多種細胞質/細胞核靶點和35種ER內瞬時蛋白，研究者進行了納米抗體的篩選。大多數sdAb靶點屬于病毒或致癌蛋白，其次是毒素和神經系統蛋白。

細胞質內抗體也在植物和果蠅中得到成功表達。單域胞內抗體部分保護了馬鈴薯植株免受馬鈴薯病毒Y的侵害。目前，研究者開發了一種監測活細胞中蛋白質敲除的通用方法。將抗GFP VHH與果蠅Slmb的F-box結構域融合，通過泛素耗盡通路以降解和GFP融合靶點蛋白。該技術被用于降解轉錄因子和參與轉基因Drosophila monogaster果蠅形態發育的相關蛋白，轉基因果蠅表達GFP-靶點融合蛋白和抗GFP的VHH片段。此外，其開發了抗eGFP-CD8跨膜結構域-細胞質mCherry的融合蛋白(簡稱Morphotrap)，用于研究表達eGFP-Dpp (Decapentaplegic，形態生成蛋白)轉基因果蠅翼片的發育情況。Morphotrap將eGFP-Dpp固定在細胞表面，抑制了翼片圖案的形成。使用具有序列選擇性和核酸水解的納米抗體用于基因沉默[22]。

大多數sdAbs已經在細胞培養中進行了評估，并且少數已經在小鼠模型中進行了研究。在移植表達相應胞內抗體的腫瘤細胞的裸鼠或NOD-SCID小鼠中，針對LMO2、F-肌動蛋白和RAS的sdAbs進行了研究[23]。在CD4+/HIVNEF轉基因小鼠的實驗中，抗HIV-1的Nef細胞內抗體能夠拯救Nef介導的胸腺CD4+T細胞成熟缺陷和外周CD4+T細胞的激活。將SH3結構域與篩選的納米抗體結合，可以增強針對HIV-1的Nef的抑制功能。此外，篩選無半胱氨酸的人源VL片段，較原始抗體具有更好的活性。將半胱氨酸殘基改變為纈氨酸和丙氨酸，可以降低抗體的親和力；可以在易錯PCR導致的隨機突變中，篩選無半胱氨酸的人源VL片段變體[24]。針對病毒蛋白、毒素、致癌蛋白和神經系統蛋白的幾種納米抗體具有潛在的治療前景。

4 細胞質/細胞核sdAbs的細胞內轉染

與病毒轉染或質粒轉染不同，細胞內抗體可以作為蛋白質遞送到胞質中。將scFv或納米抗體形式的胞內抗體遞送到靶細胞胞質中，可使遞送過程中細胞內抗體保留二硫鍵，維持了正確的折疊結構。此外，這種方法可能成為臨床應用中病毒基因轉移的安全替代方案。

研究者使用不同保護性劑進行抗體向細胞質的遞送，并與電轉技術進行了比較研究，電穿孔是目前比較有效的技術。

此外，通過使用穿透肽或靶向蛋白，與易位結構域形成的融合蛋白，可以幫助配體或抗體通過細胞膜，也可以使用穿透肽與內涵體逃逸結構域形成融合蛋白，來解決蛋白進入細胞的問題。因為內涵體逃逸效率低，所以，肽和蛋白質融合蛋白通過細胞膜到達細胞質基本無效。但是，通過核苷補救途徑，細胞穿梭抗DNA抗體可以定位于細胞核，并與特異性靶向scFv結合[25]。

細胞穿透肽具有明顯優勢，使用細胞穿透肽適配體系統可以構建TAT-鈣調蛋白融合體，以及鈣調蛋白和貨物組成的融合體。TAT-鈣調蛋白和貨物之間是非共價結合，將貨物遞送、釋放到細胞質中。另一種策略是使用細胞穿透肽和硫酸類肝素葡糖胺聚糖結合形成一個蛋白質梭肽的結構域。這些系統已經在一些難以轉染的細胞類型中成功使用，如小鼠胚胎干細胞(Mouse embryonic stem cells，mESCs)、人類胚胎干細胞和人類誘導多能干細胞(Human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)等。此外，針對HCV蛋白的駱駝源納米抗體和細胞穿透肽融合，并成功應用于HVC感染細胞中[26]。

有研究表明，成骨細胞轉錄因子Runx2可以由肽牙本質磷酸化蛋白介導，靶向到間充質細胞的細胞核，而繞過了溶酶體降解途徑。最近研發的一種血清穩定和低毒性的分子轉運蛋白，由1個剛性平面核心和4個靈活臂組成，每個臂上有1個胍基團，可以有效地將小貨物或大的活性蛋白質輸送到細胞質中。將靶向內涵體逃逸區的TAT細胞穿透肽與GFPβ11肽結合，當GFPβ11和非熒光GFPβ1-10結合時，可以激發化學形成的GFP熒光發光。這種方法可以用于篩選內涵體逃逸區[27]。

高效循環細胞穿透肽可以從內涵體中釋放，再循環利用。將納米抗體框架區的水溶性殘基突變為帶正電的精氨酸或賴氨酸，可以增加納米抗體的細胞穿透能力，將來這種抗體框架區可以作為通用支架用于抗體的細胞內輸送。

另一種方法是使用致病菌Ⅵ型分泌途徑將sdAb轉運到人類細胞中。這種sdAb的注射不需要細菌侵入或遺傳物質的轉運。

由納米抗體修飾的納米顆粒介導的特異性遞送藥物或毒素的方法，已經在許多體外實驗中得到證實，并且逐步開始進行體內實驗。聚合物基體和聚復合物是較新的人造囊泡，更易于被聚合物結構單元修飾。將sdAb或sdAb表達質粒包裹在納米顆粒中，納米顆粒被抗受體納米抗體(如：抗EGFR的納米抗體)修飾，這種修飾后的藥物納米顆粒可以遞送抗癌單域抗體到達腫瘤細胞。另外，利用轉鐵蛋白或Angiopep-2包被的納米顆粒/納米管，可以穿過血腦屏障，其中Angiopep-2是一種低密度脂蛋白受體相關蛋白-1(Low-density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP1)配體。這種遞送藥物可能被用于細胞質/細胞核單域胞內抗體(如：識別hungtington蛋白或α-Synuclein的抗體)的腦內遞送[28-30]。

5 結論

來自駱駝、鯊魚和人的單域抗體對于有效和特異性地敲除體內細胞質和細胞核蛋白是非常有用的。特異性靶向相互作用區域包括：蛋白質的構象異構體，剪接變體，亞型，翻譯后修飾位點(如：磷酸化位點等)，使得胞內抗體具有獨特的使用價值。即使有報道，RNAi可以特異性抑制Hungtington蛋白等位基因及滅活p53致癌突變[31]，RNAi技術具有明顯的脫靶效應。

在合成文庫，駱駝、鯊魚和人的單域抗體文庫中，通過噬菌體或酵母展示技術的篩選，理論上可以篩選出任何抗原和表位的大量的單域細胞內抗體。通過 CDR突變引入，突變熱點隨機化或易錯PCR構建非親和力成熟文庫，在文庫中進行高親和力抗體的篩選，進而達到抗體的親和力成熟的目的。重組慢病毒篩選技術有望代替現有的噬菌體篩選技術，用于特異性抑制性dAbs的篩選。

將細胞穿透肽、優化的內涵體逃逸結構域、sdAb表達質粒或重組sdAb嵌入到聚合物囊泡和多聚復合物囊泡的納米顆粒中，納米顆粒完成細胞質/細胞核單域胞內抗體的藥物細胞內遞送，單域胞內抗體藥物才能被應用于臨床實踐。

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