五味子乙素調(diào)控PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)大腸癌細(xì)胞SW116凋亡

王金橋，李 靖

0 引言

五味子屬植物中的一個活性單體成分五味子乙素(Schisandrin B),具有較強(qiáng)的生物活性[1]。目前對其藥理作用進(jìn)行了大量的研究，證實五味子乙素可以抑制肝細(xì)胞轉(zhuǎn)氨酶活性、抗炎、降低脂質(zhì)過氧化，表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激、護(hù)肝等生物活性[2-5]。近期研究表明，五味子乙素還表現(xiàn)出一定的抑制腫瘤功效，可以阻滯上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化達(dá)到降低乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移的目的，阻斷膽囊癌細(xì)胞的分裂周期來抑制該細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，抑制cyclin D1 mRNA的水平，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡[6-10]。大腸癌是癌癥死亡的主要原因之一，其術(shù)后生存率較低[11]，找到新的治療方法一直是大腸癌治療的研究熱點。早期研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素能夠逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細(xì)胞多藥耐藥性[12]，抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡[13]，但其對大腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制報道甚少。因此，本文探討了五味子乙素對大腸癌SW116細(xì)胞凋亡的作用及PI3K/Akt信號通路的影響，闡明其抑制腫瘤作用的關(guān)鍵靶點，為進(jìn)一步研究五味子乙素抗腫瘤作用提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料和儀器 大腸癌SW116細(xì)胞株來源于美國ATCC細(xì)胞庫；五味子乙素(杭州臨安天鴻生物科技有限公司，批號：5521-65-6，純度≥98%)；CCK8試劑盒(美國Sigma公司，批號：WH1199)；Annexin-FITC凋亡試劑盒(廣州碧云天生物試劑公司，批號：P0012S-07)；Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt、Akt及β-actin抗體購自美國Sigma公司；Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀(DX540，美國)；SDS-PAGE凝膠電泳(北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24DN)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人大腸癌細(xì)胞SW116培養(yǎng)于10%小牛血清、1 000 U/mL青霉素、80 mg/mL鏈霉素、pH 7.2的PRMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37 ℃，SW116細(xì)胞為上皮型貼壁生長，每隔2～3 d進(jìn)行傳代培養(yǎng)，接種后24 h取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。SW116細(xì)胞分為空白對照組(A組)、10 μg/mL五味子乙素組(B組)、20 μg/mL五味子乙素組(C組)及40 μg/mL五味子乙素組(D組)。其中A組細(xì)胞加入相同體積的培養(yǎng)基，細(xì)胞接種24 h后加入不同濃度的五味子乙素，繼續(xù)處理細(xì)胞24～72 h，消化收集細(xì)胞，檢測各項指標(biāo)。

1.3 CCK8實驗 將生長良好的SW116細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、收集、制備成細(xì)胞懸液，盡量吹打均勻，接種于96孔板，平行設(shè)置5個復(fù)孔。當(dāng)藥物干預(yù)細(xì)胞24 h后，吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK8試劑，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶聯(lián)免疫分析儀于450 nm處測定各孔的吸光度值。

1.4 細(xì)胞凋亡率檢測 將生長良好的SW116細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、收集，制備成細(xì)胞懸液，盡量吹打均勻，接種于6孔板。收集經(jīng)不同濃度五味子乙素處理后的SW116細(xì)胞，用無菌的PBS清洗細(xì)胞2次，2 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，加入1 μL Annexin-FITC,混勻后加入5 μL Propidium Iodide混勻；避光反應(yīng)5 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測。

1.5 細(xì)胞蛋白濃度檢測 將生長良好的SW116細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化、收集，制備成細(xì)胞懸液，盡量吹打均勻，接種于6孔板。細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理24 h后，消化收集細(xì)胞，提取蛋白并檢測蛋白濃度。每孔上樣30 μg，進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，然后電轉(zhuǎn)至NC膜，脫脂奶粉封閉1 h；進(jìn)行一抗孵育，用TBST洗膜，每10 min清洗1次，共3次，將NC膜放入稀釋好的Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt及Akt抗體(1∶1 000稀釋)中，4 ℃搖動過夜；TBST洗膜后將NC膜放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗中(1∶3 000)，室溫孵育1.5 h；TBST細(xì)胞后進(jìn)行蛋白表達(dá)量分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制實驗 CCK8法結(jié)果表明，與A組相比，不同劑量五味子乙素干預(yù)的SW116細(xì)胞生長明顯受到抑制。加入五味子乙素24 h后，不同劑量藥物干預(yù)的細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；加入五味子乙素處理細(xì)胞48、72 h后，不同濃度藥物干預(yù)后的細(xì)胞增殖受到明顯抑制，表現(xiàn)出時間依賴性。五味子乙素濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率越顯著，并且各濃度組之間的抑制作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)出劑量依賴性。見表1。

表1 五味子乙素對SW116細(xì)胞增殖抑制率的影響(%)

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，&P<0.05；與24 h時比較，△P<0.05；與48 h時比較，▲P<0.05

2.2 細(xì)胞凋亡檢測實驗 五味子乙素未干預(yù)時，4.7%的SW116細(xì)胞發(fā)生凋亡。加入五味子乙素處理后，SW116細(xì)胞凋亡明顯上升，不同劑量五味子乙素均能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞的凋亡率也逐漸增加，表現(xiàn)出濃度依賴性。五味子乙素可以明顯抑制大腸癌SW116細(xì)胞株的增殖。見圖1、表2。

圖1 五味子乙素對SW116細(xì)胞凋亡的影響

表2 五味子乙素對SW116細(xì)胞凋亡率的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，&P<0.05

2.3 五味子乙素對凋亡蛋白表達(dá)的影響 不同劑量五味子乙素對SW116細(xì)胞處理干預(yù)24 h后，采用免疫印跡技術(shù)對細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)水平檢測,結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，五味子乙素可以明顯誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，隨著五味子乙素劑量的升高,Bax表達(dá)水平也隨之升高，與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而五味子乙素可以明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，隨著藥物濃度升高，Bcl-2表達(dá)水平降低，與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 五味子乙素對Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，&P<0.05

2.4 五味子乙素對PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)的影響 不同劑量五味子乙素對SW116細(xì)胞處理干預(yù)24 h后，采用免疫印跡技術(shù)對細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路活化情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，五味子乙素可以明顯抑制PI3K、p-Akt蛋白水平，隨著五味子乙素劑量升高，PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平降低，與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Akt蛋白表達(dá)水平則沒有發(fā)生明顯的變化。說明五味子乙素可以通過抑制PI3K/Akt信號通路活化達(dá)到誘導(dǎo)SW116細(xì)胞凋亡的效果。

圖3 五味子乙素對PI3K/Akt信號通路的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，&P<0.05

3 討論

大腸癌在腫瘤死亡率中占據(jù)較高的比例，其治療方法主要為手術(shù)、放療及靶向治療等，然而該疾病的臨床治療效果并不明顯，術(shù)后5年生存率為60%，而出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶后患者的5年生存率僅為10%[14]。因此，找到一種新的治療大腸癌的方法至關(guān)重要。前期較多文獻(xiàn)報道，中藥具有改善疾病癥狀、提高免疫力、結(jié)合放化療增敏減毒、減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等功效；并且中藥在大腸癌的治療中也表現(xiàn)出較好的臨床效果[15]。中藥單體五味子乙素是從五味子中提取得到的活性成分，并且其具有較好的抗癌活性，尤其對膀胱癌、胃癌及乳腺癌等腫瘤的抑制效果較為顯著。但五味子乙素對大腸癌SW116細(xì)胞的增殖、凋亡等作用及其作用的有關(guān)機(jī)制尚未得到很好的證實。本研究結(jié)果表明，五味子乙素能夠明顯抑制SW116細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

PI3K信號通路活化介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生，并且研究證實，PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化、腫瘤的血管形成等方面發(fā)揮著重要作用[16]。還有報道提出，PI3K/Akt信號傳導(dǎo)與腫瘤的多藥耐藥關(guān)系密切[17]。在PI3K信號傳導(dǎo)過程中，當(dāng)上游信號作用細(xì)胞膜表面時，會引起酪氨酸激酶自身磷酸化或磷酸化其他作用底物，可在細(xì)胞膜內(nèi)表面產(chǎn)生PI3K結(jié)合位點，激活下游的Akt磷酸化，進(jìn)而活化或抑制其下游靶基因介導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移及侵襲的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，五味子乙素能明顯抑制PI3K/Akt信號通路的活化，主要通過抑制PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)，說明五味子乙素可以通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)SW116細(xì)胞的凋亡。Bcl-2、Bax在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起著十分重要的作用。Bax是一種促凋亡蛋白，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素可以明顯誘導(dǎo)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)SW116細(xì)胞凋亡。

綜上所述，五味子乙素能夠明顯抑制大腸癌SW116細(xì)胞的增殖，促使其凋亡，其機(jī)制可能與五味子乙素下調(diào)PI3K/Akt信號通路活化有關(guān)，繼而啟動細(xì)胞凋亡。

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