地西他濱對肥胖小鼠胰島素抵抗的作用及機制研究

高杰清，薛 靜，程 愈，張 琪，母義明，王 瑩

0 引言

胰島素抵抗作為多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)，已經(jīng)被證實是一種低度慢性炎癥[1-2]。巨噬細胞在該炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為巨噬細胞數(shù)量明顯增加，且由原來的M2型(抑炎型)為主轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型(促炎型)巨噬細胞為主[3-5]。隨后研究發(fā)現(xiàn),促進M1巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)變，增加 M2型巨噬細胞的比例可以顯著改善胰島素抵抗[6-8]。地西他濱是一種表觀調(diào)控藥物，早期大劑量應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)腫瘤；近年研究發(fā)現(xiàn),小劑量地西他濱具有免疫調(diào)節(jié)作用[9-10]。在急性肺損傷、急性心肌梗死、動脈粥樣硬化模型中發(fā)現(xiàn)，表觀調(diào)控藥物可以作用于巨噬細胞，促進M1巨噬細胞向M2極化，抑制過度炎癥發(fā)生[11-13]。前期研究中，筆者將小劑量地西他濱作用于M1型巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)其可抑制促炎因子的表達,促使M1型巨噬細胞向M2極化[14]?；诰奘杉毎硇娃D(zhuǎn)變在胰島素抵抗中的重要性，以及地西他濱對巨噬細胞極化的影響，本研究首次將地西他濱作用于高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗模型,探討小劑量地西他濱對小鼠胰島素抵抗的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 8周齡、雄性C57BL/6小鼠，18～20 g，SPF級，購自解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心。高脂飼料(D12492,美國);地西他濱(中國西安楊森)；胰島素試劑盒 (Ultrasensitive Rat Insulin ELISA，Mercodia)；Trizol RNA 提取試劑(invitrogen，美國)；PrimeScript?RT reagent Kit(Thermo，美國)和SYBR?Premix Ex TaqTM(TOYOBO，日本)；PCR引物由美國invitrogen合成；Q-PCR 儀器(Bio-Rad，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰島素抵抗模型的構(gòu)建及分組 8周齡、雄性C57BL/6小鼠普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,采用高脂飼料飼養(yǎng)12周,檢測小鼠空腹血糖、空腹胰島素，行IPGTT、IPITT試驗，檢測胰島素抵抗模型是否成功。選造模成功小鼠12只，隨機分為模型組(HFD組，n=6)、地西他濱組(DAC組，n=6)，另選6只同期正常飼料飼養(yǎng)小鼠作為對照組(NC組，n=6)。地西他濱組給予地西他濱0.25 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)5 d，其余兩組同期給予等量PBS腹腔注射。所有操作均符合實驗動物保護法。

1.2.2 指標檢測 地西他濱治療后連續(xù)監(jiān)測小鼠體重，并于治療2周后，禁食12 h，經(jīng)腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)或胰島素(1 U/kg),行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT)或胰島素耐量試驗(IPITT),分別于注射前和注射后30、60、90、120 min檢測血糖。ELISA檢測空腹胰島素(FINS)水平。穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖(FPG,mmol/L)×FINS (mU/L)/22.5。實驗結(jié)束后，小鼠斷頸處死,收集兩側(cè)附睪脂肪并稱重，一部分附睪脂肪組織凍存于液氮中用于提取RNA，另一部分置于中性甲醛溶液中固定用于制做5 μm厚度的連續(xù)石蠟切片。

1.2.3 HE 染色 新鮮脂肪組織浸入4%中性甲醛溶液中固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片后常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 qRT-PCR 檢測炎癥相關(guān)因子及巨噬細胞表面標志物的表達 脂肪組織研磨后，用Trizol法提取總RNA，微量分光光度計(美國Bio-Rad公司)檢測RNA樣品及純度。每50 μL體系各取2.5 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。取1 μL cDNA進行實時定量PCR，加入上下游引物各1 μL，SYBER Green mix 12.5 μL，無菌雙蒸水補齊至總反應(yīng)體系20 μL。以β-actin作為內(nèi)參照，基因表達相對倍數(shù)變化用 2-ΔΔCt計算。

2 結(jié)果

2.1 胰島素抵抗模型建立 開始時兩組小鼠體重相當(dāng)，飼養(yǎng)4周后，高脂喂養(yǎng)組小鼠(HFD組)較對照組(NC)體重增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；飼養(yǎng)8周后，HFD組小鼠體重增長迅速，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且差異越來越大(圖1A)。IPGTT、IPITT結(jié)果顯示，與NC組相比，HFD組小鼠糖耐量明顯減低(各時點P均<0.01，見圖1B)，胰島素敏感性顯著下降(各時點P均<0.01，見圖1C)，提示胰島素抵抗模型建立成功。

2.2 地西他濱對肥胖小鼠胰島素敏感性的影響 地西他濱治療后小鼠體重?zé)o明顯變化。與HFD組相比，地西他濱組(DAC組)小鼠葡萄糖調(diào)節(jié)能力得到明顯改善(P<0.01)(圖2A)，HOMA-IR明顯降低(P<0.01)。見圖2B。IPITT結(jié)果顯示，腹腔注射胰島素30 min時，DAC組和HFD組血糖分別下降到原來的88.0%±3.00%、92.7%±2.52%(P=0.092)；60 min時，DAC組和HFD組血糖分別下降到77.67%±2.51%、84.0%±3.00%(P=0.034)；90 min時，DAC組血糖下降幅度較HFD組高，達10%(P=0.004)；120 min時，DAC組血糖與HFD組差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015，圖2C),提示小鼠胰島素抵抗得到改善。

2.3 地西他濱對小鼠脂肪組織相關(guān)慢性炎癥的影響 與HFD組相比，DAC處理后，附睪脂肪重量明顯減輕(P=0.045，圖3A)。HE染色結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)后脂肪細胞明顯增大，間質(zhì)區(qū)細胞數(shù)量增多；DAC處理后，不僅脂肪細胞減小，間質(zhì)區(qū)細胞數(shù)量也明顯減少(圖3C)。進一步檢測脂肪組織炎癥因子的表達情況，結(jié)果顯示，HFD組促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-1β的表達明顯增加，抑炎因子IL-4、IL-10的表達明顯減少(P<0.05)；經(jīng)地西他濱處理后，MCP-1、IL-1β的表達被顯著抑制 (P<0.05)，TNF-α的表達略有下降的趨勢(P=0.12)；抑炎因子IL-4、IL-10的表達得到明顯改善 (P<0.01，圖 3B)，提示地西他濱可明顯減輕脂肪組織相關(guān)的慢性炎癥。

2.4 地西他濱對巨噬細胞表型的影響 與NC組比較，HFD組M1型巨噬細胞的表面標志物iNOS、CD11c的表達明顯增加(P<0.01)；M2 型巨噬細胞表面標志物Arg的表達明顯減少(P<0.05)。經(jīng)DAC處理后，iNOS、CD11c表達分別下降了31.89%、24.07% (P<0.01)；CD206、Arg的表達分別上調(diào)了144.44%、28.97%(P<0.01，圖4)，提示地西他濱對脂肪組織中巨噬細胞的表型起到調(diào)節(jié)作用。

圖1 胰島素抵抗小鼠模型的鑒定

圖2 地西他濱對肥胖小鼠胰島素抵抗的改善作用

圖3 地西他濱對肥胖小鼠附睪脂肪組織及其慢性炎癥的影響(HE×50)

圖4 地西他濱對脂肪組織中巨噬細胞表型的影響

3 討論

胰島素抵抗是指機體組織對胰島素的敏感性降低的一種病理狀態(tài)，由此引起的糖、脂代謝紊亂可導(dǎo)致糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等多種疾病，危害巨大。然而，目前有效的治療措施仍然非常有限。越來越多的研究探討胰島素抵抗的發(fā)病機制，目前認為，肥胖過程中大量巨噬細胞浸潤脂肪組織，并在組織中產(chǎn)生一系列炎癥因子如TNF-α、IL-1β，導(dǎo)致機體呈現(xiàn)慢性低度炎癥狀態(tài)，進而引起胰島素抵抗的產(chǎn)生[1-2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，隨著體重的增加，脂肪組織中巨噬細胞的類型也發(fā)生變化，由消瘦時的M2型巨噬細胞為主轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型巨噬細胞為主[15]。另外，促進 M1 型巨噬細胞向 M2 型極化，增加組織中M2 型巨噬細胞數(shù)量可以減輕上述炎癥反應(yīng)，顯著改善胰島素抵抗[5-8]。因此，調(diào)節(jié)巨噬細胞異常極化狀態(tài)及其相關(guān)炎癥將成為改善胰島素抵抗的重要靶點。

地西他濱是一種表觀調(diào)控藥物，早期用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。2015年《cell》的1篇文獻報道，小劑量地西他濱的抑癌作用主要是通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)實現(xiàn)的[10]。Tsai 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，地西他濱可以抑制促炎型T細胞的增殖，促進CD4+T細胞向抑炎型的Treg細胞轉(zhuǎn)化，抑制過度炎癥發(fā)生。地西他濱對DC細胞、NK細胞的研究也時有報道[17-18]。近年來，有研究者將表觀調(diào)控藥物應(yīng)用于急性肺損傷、急性心肌梗死及動脈粥樣硬化的治療，發(fā)現(xiàn)其可以作用于巨噬細胞，促進M1巨噬細胞向M2極化，抑制過度炎癥的發(fā)生[11-13]。本課題組將小劑量地西他濱直接作用于LPS誘導(dǎo)的M1型骨髓巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞的促炎能力明顯被抑制，巨噬細胞表型向M2極化[14]。關(guān)于地西他濱對巨噬細胞的這種調(diào)節(jié)作用在體內(nèi)是否同樣存在值得我們進一步探討。

本研究首次將地西他濱作用于高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗小鼠模型,治療2周后，脂肪組織中M1型巨噬細胞的表面標志物明顯下調(diào)，M2型巨噬細胞表面標志物得到明顯上調(diào)，與體外實驗相一致。同時，DAC治療組小鼠附睪脂肪含量較HFD組減少，脂肪細胞減小，促炎因子MCP-1、IL-1β的表達被顯著抑制，抑炎因子IL-4、IL-10的表達得到明顯改善，提示脂肪組織相關(guān)慢性炎癥減輕。同時，與HFD組相比，DAC組小鼠的糖耐量明顯改善、胰島素敏感性明顯提高。該結(jié)果提示，地西他濱在體內(nèi)同樣可以調(diào)節(jié)巨噬細胞表型，進而減輕巨噬細胞相關(guān)慢性炎癥，改善胰島素抵抗。

綜上所述，地西他濱不僅可以在體外促進M1型巨噬細胞向M2極化，抑制M1型巨噬細胞的促炎能力，而且在胰島素抵抗模型中同樣可以減少肥胖小鼠脂肪組織中M1型巨噬細胞數(shù)量，增加M2型巨噬細胞的數(shù)量，減輕脂肪組織相關(guān)的慢性炎癥，改善胰島素抵抗。這些特點在一定程度上為探索新型改善胰島素抵抗的藥物提供基礎(chǔ)。但是，本研究沒有揭示地西他濱調(diào)控巨噬細胞極化、改善胰島素抵抗的具體機制。因此，下一步研究將聚焦地西他濱調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的信號通路，這可能為胰島素抵抗的治療提供新的靶點。

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