檢測高效氯氟氰菊酯殘留試劑盒的研制

◎ 羅維超，扶 勝，鄧小霞，袁學偉

（貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州 貴陽 550009）

高效氯氟氰菊酯又叫三氟氯氰菊酯、功夫菊酯等，是一種廣譜菊酯類殺蟲劑，用于花生、大豆、果樹、蔬菜的害蟲防治，具有殺蟲譜廣、活性高、藥效迅速、噴灑后耐沖刷等特點。噴灑于蔬菜水果上的農藥有一部分會殘留，甚至被吸收，人類食用這些蔬菜水果就會使農藥中的高效氯氟氰菊酯進入人體，對人體產生危害。國家標準規定，高效氯氟氰菊酯在蘋果、李、柑橘等水果以及蔬菜中的最大殘留量為0.2 mg/kg[1-2]。為了了解高效氯氟氰菊酯在日常攝入的蔬菜、水果等食物中的殘留情況，以保障人民的身體健康以及實現現場大批量短時間的高效氯氟氰菊酯在農產品中的殘留檢測，本文報道了一種檢測方法同時研發出相應的產品，為相關部門進行有關農產品的快速檢測工作提供一種可靠的方法。

目前，高效氯氟氰菊酯殘留分析一般使用氣相色譜法（GC）[3]，還有一些關于高效液相色譜法（HPLC）[4]和色譜質譜聯用，這些方法靈敏度較高、測定較為準確，而且可以同時檢測多種藥物，但其檢測成本較高，而且對操作人員有較高的要求，因此限制了此種檢測方法在樣品進行現場、批量、快速檢測的使用，從而阻礙了其推廣大范圍的使用。相比于儀器檢測的方法，酶聯免疫法操作簡便、用時較短，檢測成本低、操作人員只需稍微培訓即可上手操作，可實現批量樣品的快速篩選檢測，以及技術的推廣使用。目前，在酶聯免疫分析領域具有相關的報道，只有王鳴華等進行了人工抗原的合成。目前，尚未有該方法在水果、谷物對于高效氯氟氰菊酯殘留檢測中應用的報道以及相關檢測產品的生產。本文旨在建立一種用酶聯免疫吸附分析方法快速、靈敏地檢測水果、蔬菜、谷物中高效氯氟氰菊酯，為我國農藥殘留的現場監控提供理論依據和一種可靠地途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠（6～8周齡），貴州勤邦食品安全科學技術有限公司；高效氯氟氰菊酯（純度≥99%），常熟恒榮商貿有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

勻漿機（常州市萬合儀器制造有限公司），電子天平（上海科曉科學儀器有限公司），KS-Ⅱ振蕩器（上海圣科儀器設備有限公司），QL-901漩渦混合器（常州億能實驗儀器廠），低速離心機、氮吹儀（貴州勤邦食品安全科學技術有限公司），微量移液器（單道20 ～ 200 μL、100～ 1 000 μL，多道 20 ～ 300 μL，浙江力辰儀器科技有限公司），生化培養箱（上海平軒科學儀器有限公司），酶標儀（北京線上生物科技有限公司），旋轉蒸發儀、低溫冷卻水循環泵（鞏義市予華儀器有限責任公司），三用紫外分析儀（成都啟運通儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 高效氯氟氰菊酯半抗原的合成

（1）高效氯氟氰菊酯原藥的氧化。高效氯氟氰菊酯雙鍵氧化反應如圖1所示。在三口瓶中，將高效氯氟氰菊酯溶于乙腈，并冷卻到0 ℃，開始分批加入高錳酸鉀，每批間隔3 min，加畢，保持溫度攪拌反應，當高錳酸鉀的紫色剛好褪去時，快速過濾，用10 mL丙酮洗滌濾餅，合并洗滌液和濾液，進行減壓蒸餾，得黃色油狀液體，將該油狀液體進行硅膠柱層析，干法裝柱，收集Rf值最小的那個點的組分，得到淡黃色油狀液體，即為目標產物。

圖1 高效氯氟氰菊酯雙鍵氧化反應圖

（2）半抗原的制備。將第一步的產品溶于重蒸處理過的二氯亞砜中，加入1滴DMF，氮氣保護下室溫反應過夜，次日，將反應液進行減壓蒸餾，蒸干后向剩余物中加入10 mL正己烷，蒸干，再加入，再蒸干，如此循環3次后得黃色油狀液體。將此油狀液體快速稱重確定質量，然后立即溶于干燥的四氫呋喃中，-20 ℃保存備用，將4-氨基丁酸溶于氫氧化鈉水溶液中，氫氧化鈉為1當量，冰浴冷卻到0 ℃，然后緩慢滴加冷藏于-20 ℃中酰氯的四氫呋喃溶液，滴畢，保持溫度繼續反應30 min，然后撤去冰浴恢復室溫反應2 h，TLC法確定反應完全后，停止反應，反應液分層，吸出上層溶液，將下層溶液用乙酸乙酯提取3次，每次用量10 mL，合并提取液和上層溶液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾，得黃色油狀液體，將產品用硅膠柱層析提純，收集Rf值最低的紫外點所示組分，得淡黃色油狀液體即為目標化合物。

圖2 氧化產物羧基制備酰氯接4-氨基丁酸圖

1.3.2 人工抗原的制備

免疫原的制備：稱取40 mg半抗原溶于1 mL DMF，加入60 mg EDC和40 mg NHS，室溫反應1 h；反應液澄清后，將其緩慢滴加到濃度為30 mg/mL BSA的PBS（pH7.2）中，滴畢，保持室溫攪拌過夜；用0.01 mol/L PBS透析3d，每天換2次透析液，透析完成后，以8 000 r/min離心30 min，取上清液，即為相應的免疫抗原，分裝，于-20 ℃條件下凍存備用。包被抗原的制備只將牛血清白蛋白BSA更換為卵清蛋白OVA進行和上述方法相同操作即得。

1.3.3 單克隆抗體的制備

用常規的方法制備抗體，用飽和硫酸銨來純化抗體。

1.3.4 抗原抗體最適工作濃度的選擇

分別將包被抗原和單克隆抗體溶液進行稀釋，進行間接競爭ELISA的方陣實驗，選取OD450最接近于1的抗體濃度作為抗體的最適工作濃度。

1.3.5 間接競爭酶聯免疫方法的建立

（1）酶標板的包被。用相應的緩沖液將包被原稀釋成最佳工作濃度后，點于96孔酶標板上，每孔100 μL，37 ℃避光保存2 h；棄去包被液，用洗滌液洗滌1次，拍干后每孔200 μL加入封閉液，37 ℃避光保存2h；棄去封閉液后直接拍干即完成板的包被。

（2）標準曲線的測定。加入濃度呈梯度的高效氯氟氰菊酯標準溶液和已經稀釋成最佳工作濃度的抗體溶液，每孔50 μL，蓋上蓋板膜，在25 ℃避光反應30 min后；用洗滌液洗滌四五次，拍干，加入相應的酶標二抗，每孔100 μL，蓋上蓋板膜，25 ℃避光反應30 min后；洗滌四五次，依次加入顯色底物液A液（過氧化脲）、顯色底物B液（四甲基聯苯胺），每孔加 50 μL，25 ℃顯色 15 min，每孔加入 100 μL 2 mol/L H2SO4終止液，設定酶標儀于450 nm處測定每孔吸光度值（OD值）。記錄數據，用RIDASCREEN軟件進行分析。

1.3.6 標準曲線的繪制

采用間接競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇標準品濃度0、5、15、45、135 ng/mL和405 ng/mL 6個梯度，以濃度為0 ng/L時的OD值為B0值，相應濃度的高效氯氟氰菊酯標準品的OD值為B值，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.7 樣本前處理方法的建立

（1）蘋果前處理方法。用均質器均質樣本，稱取（1.0±0.05）g均質后的蘋果樣本到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入5 mL提取劑，用渦旋儀渦動5 min；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min離心5 min；取上清液50 μL，加入到950 μL復溶液中，充分混勻，分析時每孔取50 μL點于酶標板中。

（2）大豆前處理方法。稱取（1.0±0.05）g經勻漿機均質后的大豆樣本到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入5 mL提取劑，用渦旋儀渦動5 min；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min離心5 min；取上清液50 μL，加入到950 μL復溶工作液中，充分混勻，分析時每孔取50 μL點于酶標板中。

（3）蓮花白前處理方法。用均質器均質樣本，稱取（1.0±0.05）g均質后的蔬菜樣本到10 mL聚苯乙烯離心管中，分別加入5 mL提取劑，用渦旋儀渦動5 min；室溫（20～25 ℃）4 000 r/min離心5 min；取上清液50μL，加入到950 μL復溶液中，充分混勻，分析時每孔取50 μL點于酶標板中。

1.3.8 試劑盒各項技術參數的確立

（1）樣本檢測限試驗。一定條件下，試劑盒方法檢測限（MDL）可用正態分布規律來表，因此可用20個空白樣本通過試劑盒測定的光密度在標準曲線上對應的高效氯氟氰菊酯濃度的平均值（）和標準差（S）來表示，MDL=+3S。

（2）準確度和精密度試驗。以3個不同濃度的高效氯氟氰菊酯標準品分別對空白蘋果、大豆、蓮花白樣本進行添加回收試驗，計算回收率和變異系數。

式中，Cx為添加了一定高效氯氟氰菊酯含量的樣本經過標準曲線分析得到的實際濃度，μg/kg；C0為添加空白樣本經過標準曲線分析得到的實際濃度，μg/kg；C為添加實際添加的高效氯氟氰菊酯濃度，μg/kg。

（3）穩定性試驗。將一定量的試劑盒分為數批保存于4 ℃環境中，每隔1個月取出一批，分別測定其相應零標準品的OD值、IC50，同時做添加回收實驗測得回收率，依試驗結果對試劑盒的穩定性進行判定；同時將試劑盒進行加速老化試驗，每隔1 d取出進行測定，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止。通常在37 ℃進行的加速老化實驗顯示每穩定1 d，可相當于4～10 ℃保存45 d，以此來確定試劑盒異常條件所能保存的時間。

（4）可靠性試驗。隨機抽取蘋果、大豆、蓮花白各20份，用本試劑盒方法與國家標準中的氣相色譜法分別對其進行測定，根據對比結果驗證試劑盒檢測實際樣本的準確度。

2 結果與分析

2.1 最佳工作濃度的選擇

不同包被原和單克隆抗體的間接競爭抑制ELISA方陣法測定結果（OD450值）見表1。在包被過程中，包被效果與濃度成正比，但如果濃度過高，待測物的競爭能力將會減弱，靈敏度也會受到影響，同時會造成抗原的浪費，而酶標儀測定OD450值的敏感范圍在1.00左右，綜上所述，根據表中結果，試驗的最佳選擇為包被原稀釋倍數為4.5×104，最佳抗體稀釋倍數為1∶25 000。

表1 不同包被原和單克隆抗體稀釋濃度的OD450值表

2.2 標準曲線的建立

根據建議的間接競爭ELISA方法，選擇高效氯氟 氰菊 酯 標 準 品 濃 度0、5、15、45、135 ng/mL和405 ng/mL，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標（Y），標準品濃度的對數值為橫坐標（X）繪制標準曲線，如圖3所示。其中相關系數R2=0.9984，IC50為28.8 μg/L。

圖3 高效氯氟氰菊酯的標準曲線圖

2.3 試劑盒各項技術參數的確定

2.3.1 樣本檢測限試驗由表2可知，根據MDL=+3S，得到試劑盒方法對蘋果、玉米、白菜樣本的檢測限分別為9.25、13.94、43.37 μg/kg。

表2 高效氯氟氰菊酯試劑盒方法檢測限表

2.3.2 準確度和精密度試驗

ELISA測定的準確度以回收率表示，精密度以變異系數表示。取空白蘋果、大豆、蓮花白樣本，按表2所述的高效氯氟氰菊酯添加濃度對其進行添加回收試驗，每個濃度做5個平行，用3個批次的試劑盒測定，各計算出回收率和批內、批間變異系數，見表3。

表3 高效氯氟氰菊酯試劑盒的準確度和精密度表

由表3可知，以3個不同濃度的高效氯氟氰菊酯標準品對空白蘋果、大豆、蓮花白樣本進行添加，其加標回收率范圍為68.8%～105.3%，說明試劑盒準確度較好；批內變異系數范圍為7.1%～13.2%，批間變異系數范圍為7.9%～13.1%，均小于15%，說明試劑盒精密度以及重復性較好。

2.3.3 穩定性試驗

將試劑盒分別放置于4 ℃和37 ℃，每隔一定時間取出，根據試劑盒的靈敏度和回收率等參數，判斷其穩定性。經測定，該試劑盒能在37℃條件下穩定保存9 d，第10 d開始各項參數開始下降，而在4 ℃條件下至少保存15個月仍可保持靈敏度和回收率等參數。

2.3.4 可靠性試驗

通過試劑盒方法和儀器方法對隨機抽取的蘋果、大豆、蓮花白樣本進行測定，蘋果、大豆、蓮花白樣本的陽性判定限分別為20、30、60 μg/kg，結果篩選出1份陽性蘋果樣本和3份陽性蓮花白樣本，比較結果見表4。

表4 ELISA法和GC法檢測結果比較表（單位：μg/kg）

由表4可知，對高效氯氟氰菊酯殘留的測定用ELISA法和GC法的測定結果基本一致，符合度達到99%以上。

3 結論

高效氯氟氰菊酯很耐雨水沖刷，從而易殘留在農產品中，甚至被農產品吸收。人們攝取這些殘留了高效氯氟氰菊酯的蔬菜以后，極易在人體中大量富集，影響人們的身體健康，而目前，高效氯氟氰菊酯在水稻、蔬菜、果樹等農作物中還在廣泛使用，非常有必要對其含量進行監控，保障人民的身體健康，這就決定了在人們經常獲取農產品的菜場、超市等場所必須有一定力度的農藥殘留抽檢工作，若用儀器方法進行抽檢，雖然檢測的靈敏度和準確度都非常高，可是單個樣品的檢測所用時間較長，而且需要專門的人負責檢測工作，這就造成了檢測效率低下的后果，非常不利于廣泛的推廣使用，而ELISA試劑盒則不需要專業的人員進行操作，稍微進行培訓就可以進行檢測工作，甚至可用于商家自身對產品的檢測，由于其單個樣品檢測所用的時間較短，所以通常用于大批量的樣品進行抽檢，檢測的靈敏度和儀器方法幾乎一致，是一種值得信賴的檢測方法。

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