兩種組合顯色系統用于分枝桿菌快速藥物敏感性試驗的性能研究

孫戰強

結核病是全球范圍內重大傳染病之一[1]。隨著耐多藥結核病和廣泛耐藥結核病疫情的快速上升，簡單、快速和高效的結核分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)技術成為迫切需求。基于耐藥突變基因的分子生物學方法因結核分枝桿菌耐藥機制的復雜性，仍不能完全滿足臨床需求[2]。而細菌學藥敏試驗和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定成為抗結核新藥篩選[3]和個體化精準治療的重要手段。近年來，基于氧化還原代謝原理并廣泛應用于細胞培養、細菌增殖的方法，如阿爾瑪藍法、刃天青法、四唑鹽法等顯色方法，因簡單、快速、價廉等優勢在結核分枝桿菌的快速藥敏試驗中得到廣泛應用[4-7]。其中，四唑鹽法，尤其是新一代的水溶性四唑鹽3,3′-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸鈉(XTT)因其背景值低、顯色快、試劑組合多變、價格低廉等特點使其更具有抗結核藥物高通量篩選和快速進行藥敏試驗的潛能。通常，XTT通過細胞跨膜電子傳遞系統發生帶顏色變化的還原反應，但XTT帶有較高的負電荷難以接近或透過細胞膜，顯色速度緩慢，一旦加入合適的中間電子受體進行介導則可提高反應速度[8-9]。前期研究中，筆者發現XTT/1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯(mPMS)組合顯色系統(簡稱“XTT/mPMS”)可用于抗結核藥物高通量篩選[10]。在此基礎上，筆者進一步深入檢測XTT/mPMS及其對照XTT/2-甲基-1,4-萘醌(mNQ)組合顯色系統(簡稱“XTT/mNQ”)用于分枝桿菌快速藥敏試驗的性能，并對XTT/mPMS用于結核分枝桿菌臨床分離株快速藥敏測定的性能進行評估。

材料和方法

1.材料：結核分枝桿菌 H37Ra(ATCC 27294)和牛分枝桿菌BCG(ATCC 35745)由河南省胸科醫院提供，恥垢分枝桿菌mc2155為本實驗室保存菌株。XTT、mPMS(1-methoxy-PMS)、mNQ(2-methyl-1,4-NQ)、刃天青、利福平(RFP)、異煙肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm)、左氧氟沙星(Lfx)等試劑購自美國Sigma公司；米氏7H9(Middlebrook 7H9)培養基和營養添加劑[油酸-白蛋白-右旋糖-過氧化氫酶(OADC)]購自美國BD公司；羅氏培養基購自上海成海公司；中國細菌濁度標準由中國藥品生物制品檢定所提供(批號為2009-1)。DH6000AB型恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器廠)、AM-9602A型酶標儀(美國AMIS Medical公司)。

2.菌液制備：參考文獻[10]，比濁法配制1麥式濃度(約1.5×108CFU/ml)的菌液。即：結核分枝桿菌H37Ra、牛分枝桿菌、恥垢分枝桿菌活化后，挑取單菌落轉移至含0.05% Tween-80的7H9-S(7H9+OADC)液體培養基中繼續培養。待分枝桿菌生長到對數期后吸取菌液，用2～4 mm的玻璃珠漩渦振蕩2～5 min磨菌，比濁法調整菌液濃度至1麥式濃度。

3.試劑制備：XTT、刃天青溶于1×磷酸鹽緩沖液(PBS)，mPMS溶于雙蒸水，mNQ溶于二甲基亞砜，XTT、mPMS和mNQ分別配制成0.2～48.0 mmol/L、0.2～12.8 mmol/L和0.2～12.8 mmol/L濃度。所有試劑用0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存(XTT于-20 ℃保存)備用。使用時各取10 μl單獨加樣或直接混合后再加樣。

4.XTT微量顯色檢測：將培養好的菌株用7H9培養基稀釋并調節濃度。在96孔培養板中每孔加入菌懸液180 μl，分別加入中間電子受體和XTT各10 μl，37 ℃培養2～4 h后采用450 nm酶標儀判讀。

5.XTT和中間電子受體(IEAs)濃度優化：正交試驗設計，XTT濃度0.0～2.4 mmol/L，mPMS濃度0.00～0.64 mmol/L，mNQ濃度0.0～6.4 mmol/L，培養時間0～8 h，菌懸液濃度(0.0～3.0)×109CFU/ml，每個因子按5個水平分析。根據初步優化結果，采用L25(25)矩陣法進一步優化，將XTT濃度0.00～0.25 mmol/L和IEAs濃度0.00～0.08 mmol/L設置5個水平，進行上述的微量顯色檢測，最終獲得最佳組合濃度，試驗重復3次。

6.顯色系統穩定性評估：根據上述最佳優化濃度，配制含XTT、mPMS、mNQ、XTT/mPMS和XTT/mNQ的7H9培養基，在96孔板中每孔80 μl，37 ℃培養8 d。將100 μl活化好的恥垢分枝桿菌菌懸液(1.5×108CFU/ml)，于每天分別加到上述含顯色試劑96孔板的未加過菌懸液的新孔中，再共同培養90 min后于紫外分光光度計判讀450 nm 波長處吸光度值(A450值)，持續8 d。

分別準備適宜濃度的如下試劑溶液：XTT/mPMS、XTT/mNQ、XTT、mPMS、mNQ，每管40 μl分裝到數個500 μl EP管中，于4 ℃和25 ℃不同溫度條件儲存試劑。每隔5 d取出一管試劑，采用上述的XTT微量顯色法進行長時間穩定性檢測。

7.藥物干擾實驗：96微孔板中用7H9液體培養基二倍稀釋法將常見抗結核藥物RFP、INH、EMB、Sm、Lfx等梯度稀釋成一系列的藥物濃度(500.00～15.62 μg/ml)。各試驗孔再加入20 μl的XTT/mPMS或者XTT/mNQ顯色試劑混合物。37 ℃恒溫培養15 d，每隔1 d在450 nm波長下檢測A450值。各試驗孔重復3次。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統圖1 XTT/IEAs顯色系統優化試驗

8.細胞毒性試驗：在96微孔板中，20 μl XTT/mPMS或XTT/mNQ顯色試劑混合物與180 μl恥垢分枝桿菌菌液(1.5×105CFU/ml)37 ℃恒溫培養72 h，未加顯色試劑的菌液作為陽性對照，每隔6 h取10 μl培養液采用文獻[11]方法進行菌落形成單位(CFU)計數。同樣的方法在牛分枝桿菌和結核分枝桿菌中共培養18 d，每隔2 d對CFU計數檢測1次，每次試驗重復3次。

9.XTT/mPMS顯色系統臨床評估：取藥敏試驗結果明確(固體培養法)的結核分枝桿菌臨床分離株40株[敏感株(S)10株、單耐藥(DR)10株、耐多藥(MDR)10株、廣泛耐藥(XDR)10株]。對常見抗結核藥物的MIC檢測按照文獻[4]方法，略有修改。二倍稀釋法將抗結核藥物用每孔100 μl的 7H9-OADC 液體培養基于96微孔板中進行梯度稀釋至如下濃度：128.00～0.25 μg/ml(RFP)、32.00～0.06 μg/ml(INH)，生長對照孔不加藥物。每孔加入100 μl菌液(0.5麥式濁度，再1∶20稀釋)，37 ℃恒溫培養6～7 d，于第5天每孔加入20 μl的XTT/mPMS顯示試劑，再繼續培養4 h，顯色劑顏色由無色或淡黃色變化為深黃色或棕色，將阻止顏色變化孔所對應的藥物濃度判為MIC值。如判讀不明顯的培養孔繼續培養24 h后再判讀。刃天青MIC檢測方法同上，加入20 μl(濃度為0.1 g/L)顯示試劑后培養過夜，再如上述方法判讀(藍色變為紫紅色)。藥敏折點值設置：RFP為0.5 μg/ml，INH為0.25 μg/ml。

10.統計學分析：采用SPASS 13.0軟件進行分析。計算檢測效能指標，相關計算公式：敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%。線性判斷采用Excel 2007軟件中的線性回歸分析。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統圖2 不同菌株在XTT/IEAs顯色系統中顯色效果與與培養時間的線性關系

結 果

1.顯色劑的最優配制比例：根據正交實驗分析，多因素與A450值的關系如圖1所示。發現在XTT與IEAs共培養中，mPMS的濃度達到0.04 mmol/L后，A450值達到一個平臺，而mNQ的濃度達到0.04 mmol/L 后A450值開始降低。 XTT濃度達到0.2 mmol/L后A450值達到2.0，濃度0.25 mmol/L時A450值達到最高。因此，確定兩個顯色系統的最優濃度為0.2 mmol/L的XTT和0.04 mmol/L的中間電子受體。

圖a顯示XTT/mPMS顯色系統，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統圖3 XTT/IEAs顯色系統檢測限線性范圍試驗

2.顯色系統培養時間：對于恥垢分枝桿菌，XTT/mPMS顯色系統的顏色A450值在前90 min內呈線性(圖2a)，XTT/mNQ顯色系統的顏色A450值于60 min就達到平臺期(圖2b)。對于結核分枝桿菌和牛分枝桿菌，兩種顯色系統的顏色A450值到420 min仍保持線性(R2值均大于0.9)，但XTT/mPMS系統的信噪比更高，其A450值接近0.5(圖2)。

3.細胞增殖和敏感度分析：XTT/mPMS 系統的顏色A450值與結核分枝桿菌在2.4×107～7.5×108CFU/ml濃度范圍內呈線性關系；對于恥垢分枝桿菌，僅在2.4×107～3.7×108CFU/ml呈線性關系(圖3a)。而XTT/mNQ系統具有更寬的線性檢測范圍(圖3b)。 此外，XTT/IEAs的顯色反應強度存在種屬差異，即生長迅速的恥垢分枝桿菌顯色反應強度明顯高于其他分枝桿菌(圖3)。

圖a、b顯示XTT/IEAs顯色系統在7H9液體培養基中的穩定性；圖a顯示XTT/mPMS顯色系統，圖b顯示XTT/mNQ顯色系統。圖c、d顯示XTT/IEAs顯色系統在儲存條件下的穩定性。圖c為顯色系統在4 ℃儲存1個月， 圖d為顯色系統在25 ℃儲存1個月圖4 XTT/IEAs顯色系統穩定性試驗

4.顯色系統穩定性分析：通過不同溫度儲存條件的試劑穩定性實驗發現，XTT/mPMS與7H9培養基共孵育時，其穩定性至少保持7 d(圖4a)，但同樣條件下XTT/mNQ僅能維持2 d(圖4b)。導致XTT/mNQ系統穩定性下降的原因是mNQ穩定性差(圖4b)。由于在預實驗中發現XTT/IEAs熱穩定性較低，40 ℃下失效嚴重，因此未能得到有效的加速破壞實驗數據，但得到了25 ℃常溫和4 ℃低溫儲存數據。XTT/mPMS在4 ℃儲存條件下，顯色性能至少能持續30 d(圖4c)，而XTT/mNQ系統4 ℃存儲5 d后，基本失效(圖4c)。與單組分儲存方式相比，顯色試劑混合物在存儲中會發生少量的非細胞還原反應。在25 ℃存儲條件下，XTT/mPMS存儲10 d后其顯色效能開始明顯下降，其原因是XTT開始失效(圖4d)。而在XTT/mNQ顯色系統中，由于mNQ穩定性差，存儲到5 d后，其顯色性能已明顯降低到無法使用(圖4d)。

5.顯色系統的細胞毒性試驗：細胞毒性實驗中XTT/mPMS與生長迅速的恥垢分枝桿菌共培養時，可使其到達生長穩定期的時間延后12 h(圖5a)，但最終到達穩定期的菌落數與對照組接近。在生長緩慢的牛分枝桿菌和結核分枝桿菌中，XTT/mPMS使分枝桿菌到達生長穩定期的時間延后1～2 d，但最終達到穩定期的菌液濃度與對照組接近(圖5b，c)。因此XTT/mPMS對分枝桿菌的生長具有較低的細胞毒性。而XTT/mNQ系統與恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌和結核分枝桿菌共培養時，試驗組比對照組均出現明顯的生長延遲，達到穩定期后，菌液濃度也相對較低(圖5)。在3種分枝桿菌中，XTT/mPMS和XTT/mNQ均具有一定的細胞毒性作用，但XTT/mPMS的細胞毒性更低。

圖a為恥垢分枝桿菌，圖b為牛分枝桿菌，圖c為結核分枝桿菌圖5 XTT/IEAs 顯色系統細胞毒性分析

圖a顯示RFP干擾，圖b顯示INH干擾，圖c顯示Sm干擾，圖d顯示EMB干擾，圖e顯示Lfx干擾圖6 抗結核藥物對XTT/mPMS顯色系統的干擾檢測

6.XTT/IEAs受抗結核藥物干擾檢測：顯色系統在臨床使用中需要和抗結核藥物共培養，抗結核藥物自身所帶顏色可能會干擾顯色系統的正常判讀；此外，一些抗結核藥物可能會與顯色系統發生非細胞還原反應。XTT/mPMS系統中，RFP的淡黃色可干擾XTT/mPMS的顯色讀數，這種干擾具有濃度依賴性，RFP濃度達到62.5 μg/ml以后，本底值已接近1.0，干擾嚴重(圖6a)。在INH中，高濃度的INH與顯色系統在共培養7 d以后，吸光度值接近1.0，干擾也比較嚴重(圖6b)。而Sm、EMB、Lfx等抗結核藥物均不與XTT/mPMS顯色系統發生非細胞還原反應(圖6)。

7. XTT/IEAs臨床藥敏試驗檢測：選擇藥敏試驗結果已知(固體培養法)的40株結核分枝桿菌臨床分離株，同時采用XTT/mPMS和刃天青顯色系統進行RFP和INH的MIC檢測，結果如表1、2。 XTT/mPMS的藥敏試驗結果與刃天青一致。在對RFP和INH兩種藥物的檢測中，XTT/mPMS顯色法的敏感度和特異度都達到90%以上。陽性預測值和陰性預測值也都比較高。在臨床試驗中，XTT/mPMS組多在5～6 d獲得藥敏試驗結果，刃天青組多在6～7 d獲得藥敏試驗結果。

討 論

四唑鹽廣泛用于動物和微生物的藥敏試驗、活性、增殖等檢測，以及藥物篩選。在這些應用中，目前最常用的水溶性四唑鹽是XTT，該化合物可產生水溶性甲臢便于后續操作和觀察[6, 12]。一般而言，XTT顯色系統需搭配IEAs以提高反應速度，作為該顯色反應系統核心成分的IEAs，常見的有苯醌、萘醌、蒽醌和吩嗪硫酸甲酯類化合物[8]。前期工作中，筆者通過大量的篩選和測試，發現XTT/mNQ可以用于抗結核藥物高通量篩選[10]。因此，筆者預測該顯色系統在分枝桿菌快速藥敏試驗中具有較強的優勢。

傳統的XTT/mNQ顯色系統因其穩定性差，給臨床大規模使用造成諸多障礙。首先，XTT/mNQ只能用于分枝桿菌液體培養后的終點加樣檢測。其次，終點加樣步驟增加了實驗操作人員的生物安全風險。再次，XTT/mNQ顯色系統失效很快，只能是即用型試劑，既難以用于檢測試劑盒開發，也給臨床實際使用帶來巨大浪費。筆者發現，造成XTT/mNQ顯色系統失效的主要原因是mNQ的穩定性較差。而XTT/mPMS系統在7H9液體培養基37 ℃ 共培養條件下至少8 d內仍然穩定，表明其具有與分枝桿菌共培養的潛能。即便在25 ℃儲存條件，XTT/mPMS仍具有至少保持15 d的穩定性，表明其具有開發成藥敏試驗試劑盒的潛能。然而遺憾的是，筆者前期研究中已經發現XTT/mPMS會與7H9液體培養基中的營養添加劑OADC發生緩慢的顯色反應[10]，使其在使用7H9+OADC培養基的分枝桿菌長期共培養快速藥敏試驗中受限。但這提示，在臨床上XTT/mPMS可用于快速生長型非結核分枝桿菌的共培養藥敏試驗，以及不包含OADC成分的其他液體培養基的長期共培養藥敏試驗。

表1 XTT/mPMS顯色系統以固體培養法為金標準的耐藥檢測效能

表2 刃天青顯色系統以固體培養法為金標準的耐藥檢測效能

此外，盡管筆者發現高濃度RFP的淡黃色，以及高濃度的INH與XTT/mPMS長時間共培養時可與其發生緩慢的顯色反應后的淡黃色，給XTT/mPMS顯色判讀帶來干擾，但實驗中的藥物測試濃度遠高于臨床藥敏試驗的實際使用濃度，因此這一潛在的缺點并不影響臨床上的實際使用。

本研究中，XTT的顯色反應原理是基于細菌的氧化還原反應，這會依耐于菌株本身的活力。XTT顏色變化時間也高度依賴菌懸液濃度，濃度越高顯色越快。一個有趣的現象是，在同樣菌液濃度(麥氏1號)下，XTT在恥垢分枝桿菌培養液中顏色A450值達到平臺期需要60～90 min，而結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中至少需要420 min。這些現象共同表明，分枝桿菌的菌液濃度、種屬、細菌活力等因素會影響顯色反應的速度和顯色強度。因為XTT顯色強度具有試劑濃度依耐性，這提示在臨床實際使用中可通過適當提高XTT和mPMS試劑的濃度和延長判讀時間來彌補以上缺陷。

在臨床評估中，筆者發現XTT/mPMS顯色系統和刃天青法的藥敏試驗結果幾乎相同。相對于刃天青顯色法需要過夜再培養的情況，XTT/mPMS顯色系統在加入試劑后2 h即可判讀結果，更具有明顯的優勢。筆者亦發現在MIC肉眼判讀時，對于那些顏色反應臨界點難以判讀的狀態，XTT/mPMS的淡黃色比刃天青的藍色、紫色混合顏色更容易判讀(數據未展示)。此外，在臨床測試的終點加樣中，出現了1例污染，刃天青法因需過夜培養，最終未能準確判讀污染樣本的MIC值, 而XTT/mPMS終點加樣后只需2 h后即可判讀結果，規避了終點加樣操作引入污染的現象。

綜上，筆者對XTT/mPMS在分枝桿菌快速藥敏試驗的配方優化和性能進行了系統性評估，首次闡明了XTT/mPMS顯色系統在分枝桿菌液體培養中的穩定性、細胞毒性、藥物干擾反應特性，以及初步的臨床藥敏檢測效能。結果表明，XTT/mPMS顯色系統可以用于分枝桿菌快速藥敏或MIC檢測。本研究為臨床上使用簡單、廉價、高效的分枝桿菌MIC快速檢測、適用于分枝桿菌MIC快速檢測共培養試劑的研發，以及基于細菌學的抗分枝桿菌藥物高通量篩選技術的運用提供重要參考。

志謝感謝張朝寶同學在研究生階段參與了預試驗和文獻檢索工作，感謝趙俊偉同學和玄松花同學給予了工作上的協助。感謝武漢醫療救治中心檢驗科馬峻醫生及其相關同事對臨床實驗的支持和幫助。

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