菟絲子總提物對雷公藤多苷POF大鼠模型影響的探討

★ 管雁丞 何中平 黃長盛 周汝云 黎德育（.深圳市中醫(yī)院婦產(chǎn)科 廣東 深圳58034；.深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)風(fēng)濕科 廣東 深圳 50000）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40歲前，卵巢儲備功能衰退，以高促性腺激素、低雌激素水平為主要臨床表現(xiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病。發(fā)病率為1%～3%［1］，約10%的育齡期女性不孕癥由 POF 所導(dǎo)致［2］，嚴(yán)重危害了婦女的身心健康。隨著自身免疫性疾病等發(fā)病率逐年增加，接受免疫抑制劑治療的患者越來越多。臨床研究證實，多種免疫抑制劑可引起POF，故本實驗立足于雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠模型，采用減味壽胎丸（去阿膠）主藥-菟絲子總提物進(jìn)行干預(yù)，初步探討減味壽胎丸的主要作用成分及其機(jī)制。具體如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠，重230～250g，周齡約8周，共44只，由廣東省動物實驗中心提供（動物合格證號：SYXK（粵）2014-0140）。飼養(yǎng)于深圳大學(xué)SPF級動物房。

1.2 實驗藥品 雷公藤多苷懸浮液：將雷公藤多苷片（黃石飛云制藥有限公司，產(chǎn)品批號：20151203，國藥準(zhǔn)字：Z42021212）配置成濃度為15mg/mL的懸浮液。

補(bǔ)佳樂水溶液：將戊酸雌二醇片（1mg/片，DELPHARM Lille S.A.S產(chǎn)，生產(chǎn)批號：278A，國藥準(zhǔn)字：J20130009。）配置成濃度為0.02mg/mL的懸浮液。

菟絲子總提物：取干燥菟絲子藥材（康美藥業(yè)）1000g，總提物為醇提物與水提物所得浸膏合并所得。根據(jù)人鼠體表面積換算公式，折算系數(shù)為6.25，采用6倍等效劑量。大鼠日用量（g）=6×成人日用量（30g）/60kg×6.25/1000×提取率（0.18）×大鼠體重（g）。用生理鹽水溶解菟絲子干浸膏，調(diào)整濃度為0.15g/mL。

1.3 實驗方法 大鼠進(jìn)入SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，連續(xù)10d每日取大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片觀察動情周期，選取有正常動情周期大鼠共44只納入實驗，隨機(jī)分為4組：對照組、模型組、補(bǔ)佳樂組、菟絲子總提物組（簡稱TSZ組），每組各11只。對照組予等劑量純凈水，余下各組給予雷公藤多苷混懸液75mg/（kg·d）灌胃，日1次，連續(xù)30d。30d后，空白對照組、模型組繼續(xù)予等量純凈水灌胃；補(bǔ)佳樂組以補(bǔ)佳樂水溶液灌胃，給藥量0.1mg/kg/d；TSZ組：予菟絲子總提物水溶液灌胃，給藥量（g）=3.375×大鼠體重（g），日1次，連續(xù)30d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 動情周期的觀察 每日上午九時開始進(jìn)行陰道涂片觀察動情周期變化。具體步驟：將生理鹽水蘸濕的無菌棉簽輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，輕柔旋轉(zhuǎn)一圈后取出，迅速將分泌物涂布于玻片，然后置于10×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察。正常大鼠動情周期為4～5d，且按動情前期、動情期、動情后期、動情間期變化，周而復(fù)始，具有規(guī)律性。動情周期各階段判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻(xiàn)［3］，具體見表1。

表1 動情周期各階段判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 血清激素及細(xì)胞因子水平檢測 給藥結(jié)束后1～5d內(nèi)選擇非動情期大鼠，腹主動脈取血、處死，離心取血清后，采用ELISA法檢測血清E2、FSH、LH、AMH水平。

1.4.3 卵泡計數(shù)及卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 取出同側(cè)卵巢后，快速置于4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋，從最大剖面以4μm厚度連續(xù)切片6張，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下（10×10倍）觀察卵巢組織形態(tài)改變，根據(jù)卵泡結(jié)構(gòu)及大小對卵泡分級，分級標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻(xiàn)［4］，計數(shù)最大剖面的生長卵泡、黃體及閉鎖卵泡。（深圳市第六人民醫(yī)院病理科協(xié)助）

2 統(tǒng)計學(xué)處理

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠動情周期的觀察 為方便統(tǒng)計研究，以兩個動情周期即10d，作為觀察點，即以D1-D10、D11-D20、D21-D30動情周期變化來對比研究。實驗發(fā)現(xiàn)造模約10d開始，部分大鼠動情周期逐漸紊亂，無規(guī)律性，或者部分大鼠動情周期延長至6～9d。造模第30d，大鼠均動情周期紊亂或延長（造模期間，有2只大鼠因操作失誤死亡）。干預(yù)期間，TSZ組動情周期基本恢復(fù)規(guī)律，與補(bǔ)佳樂組相仿，具體見表2。

表2 大鼠動情周期的變化 只

3.2 大鼠血清激素水平及細(xì)胞因子的比較 與對照組比較，模型組E2水平明顯降低，F(xiàn)SH、LH、AMH水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組，兩治療組E2水平升高，F(xiàn)SH、LH、AMH升高（P＜0.01或0.05）；與對照組比較，兩治療組無顯著性差異，兩治療組組間比較無顯著性差異（P＞0.05），見表3。

表3 血清激素水平及細(xì)胞因子的比較

3.3 大鼠卵泡計數(shù)的比較 與對照組比較，模型組生長卵泡及黃體數(shù)量明顯減少，閉鎖卵泡明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，兩治療組生長卵泡及黃體增多（P＜0.01或 0.05），閉鎖卵泡減少（P＜0.05）；與對照組比較，兩治療組無顯著性差異，兩治療組組間比較無顯著性差異（P＞0.05），見表4。

表4 大鼠卵泡計數(shù)的比較 個

3.4 卵巢病理切片 對照組鏡下可見卵巢血運豐富，各級卵泡生長活躍，黃體發(fā)育良好。模型組肉眼可見大鼠卵巢萎縮蒼白，部分卵巢組織纖維化明顯。鏡下見生長卵泡明顯減少，成熟卵泡基本未見，閉鎖卵泡明顯增多，部分可見空囊泡，黃體數(shù)量少，間質(zhì)可見纖維組織增生。治療組大鼠卵巢鏡下各級卵泡較模型組明顯增多，可見成熟卵泡，黃體數(shù)量增加，可見少量閉鎖卵泡，間質(zhì)未見明顯纖維組織增生。見下圖1-4（HE染色，10×10）。

圖1 正常組

圖2 模型組

圖3 補(bǔ)佳樂組

圖4 TSZ組

4 討論

雷公藤類藥物為臨床常用抗免疫風(fēng)濕類藥物，臨床有研究認(rèn)為生殖系統(tǒng)損傷的發(fā)生與其日用量關(guān)系密切［5］。另亦與它的累積劑量有明顯關(guān)系。雷公藤多苷累積劑量＞8000mg時，閉經(jīng)發(fā)生率為95%［6］。亦有報道，雷公藤的自身免疫治療劑量明顯高于其有效抗生育閾劑量［7］，表明雷公藤在發(fā)揮免疫抑制作用的同時，不可避免地影響到生殖功能。

近年來，雷公藤致卵巢早衰模型的研究頗多。用藥劑量10mg/kg至75mg/kg不等，大多研究集中于40mg/kg至75mg/kg。大鼠的動情周期為4～5d，文獻(xiàn)研究報道，用藥時間為10d至10周不等。高慧等［8］以雌性大鼠為研究載體，分別用雷公藤5mg/（kg·28d）、10mg/（kg·28d）、20mg/（kg·28d）、50mg/（kg·14d）、50mg/（kg·28d）、75mg/（kg·14d）、75mg/（kg·28d） 、100mg/（kg·14d）、100mg/（kg·28d）進(jìn)行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以50mg/（kg·14d）成模最理想，75mg/（kg·14d）模者次之，75mg/（kg·28d）較75mg/（kg·15d）卵巢功能損傷程度重；吳克明等［9］以雌性小鼠為研究載體，通過研究發(fā)現(xiàn)40mg/kg·10w為最佳造模劑量，同時觀察到停藥4周，小鼠卵巢功能即可恢復(fù)。

筆者通過大量前期研究，并重復(fù)實驗研究比對了3月齡、6月齡及11～12月齡三個不同月齡段大鼠卵巢功能損傷程度，發(fā)現(xiàn)75mg/（kg·30d）的造模方法可更穩(wěn)定、可靠地致卵巢儲備功能下降［10］；3月齡及6月齡大鼠卵巢功能損傷程度大致相仿，且有進(jìn)一步加重的趨勢，而11～12月齡初老大鼠在生理上接近卵巢功能衰退期，造模后，卵巢儲備功能明顯下降。故本實驗選用75mg/（kg·30d），性活躍期大鼠的造模方法重復(fù)實驗。

根據(jù)臨床癥狀，該病應(yīng)屬于祖國醫(yī)學(xué)“閉經(jīng)”“年未老經(jīng)水?dāng)唷薄安辉小钡确懂牎Ｖ嗅t(yī)認(rèn)為此類藥物應(yīng)屬于邪毒，直接損傷胞宮，導(dǎo)致沖任失調(diào)或直接損傷沖任二脈，通過生殖軸影響腎與天癸；雷公藤致卵巢早衰的主要病因為腎陰陽兩虛，治療應(yīng)以補(bǔ)腎為主，且平調(diào)腎陰腎陽最佳。據(jù)近年來文獻(xiàn)報道，藥源性卵巢早衰的臨床觀察及實驗研究均使用補(bǔ)腎法，常選用左歸丸、右歸丸、歸腎丸等補(bǔ)腎名方，均有顯效。此類方劑藥味較多，不便于臨床新藥開發(fā)。

本課題組前期研究中，采用藥少而力專的減味壽胎丸進(jìn)行研究，實驗表明，減味壽胎丸能成功拮抗、修復(fù)雷公藤誘導(dǎo)的卵巢損傷。菟絲子是該方君藥，性味甘平，平補(bǔ)腎陰腎陽，益精養(yǎng)血。近年研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子主要有效成分菟絲子黃酮具有類雌激素活性，一方面能調(diào)控凋亡相關(guān)基因，抑制顆粒細(xì)胞凋亡；一方面能調(diào)控顆粒細(xì)胞分泌性激素和細(xì)胞因子的能力，以延緩卵泡閉鎖［11］。槲皮素屬于菟絲子黃酮主要藥用成分之一，實驗證明其具有類雌激素作用，可以抑制生殖細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵泡發(fā)育［12］。故本研究運用菟絲子單味藥進(jìn)行藥源性卵巢早衰大鼠的干預(yù)性研究，以期初步探討減味壽胎丸的主要藥物成分及其作用機(jī)制，以指導(dǎo)臨床用藥。

本研究發(fā)現(xiàn)，造模第30d大鼠基本出現(xiàn)動情周期紊亂、延長，造模成功；干預(yù)實驗中，菟絲子總提物能顯著提高血清E2，降低血清FSH及LH；能顯著升高AMH；能增加生長卵泡數(shù)量，延緩或減少卵泡閉鎖，減輕大鼠卵巢間質(zhì)纖維樣改變，改善大鼠卵巢損傷，避免卵巢萎縮，增加卵巢指數(shù)。

由此可見，菟絲子總提物可能具有類激素樣作用，直接提高了卵巢對促性腺激素的反應(yīng)性，使E2升高，F(xiàn)SH、FSH/LH降低，從而改善卵巢功能；AMH明顯升高，亦說明卵巢儲備能力提高；并延緩了POF的病理進(jìn)程。

5 結(jié)論

菟絲子作為減味壽胎丸主藥，其總提物可顯著提高卵巢儲備能力，修復(fù)卵巢組織損傷，可指導(dǎo)臨床用藥，并為新藥開發(fā)指明方向。

［1］Haller-Kikkatalo K, Uibo R, Kurg A, et al. The prevalence and phenotypic characteristics of spontaneous premature ovarian failure: a general population registry-based study [J]. Hum Reprod, 2015, 30(5):1 229-1 238.

［2］Coulam C B, Adamson S C, Annegers J F. Incidence of premature ovarian failure [J]. Obstet Gynecol, 1986, 67(4):604-606.

［3］魏漲.醫(yī)學(xué)實驗學(xué)[M].重慶:四川科學(xué)技術(shù)出版社, 1998:164-165.

［4］Myers M, Britt K L, Wreford N G, et al. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary [J]. Reproduction, 2004, 127(5):569-580.

［5］邱穎文，吳松武，吳賢仁.雷公藤多苷的不良反應(yīng)[J].西北藥學(xué)雜志,2004, 19(5):220-222.

［6］谷春霞. 雷公藤多苷片所致閉經(jīng)原因探討：附83例分析[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報, 1989, 11(2):151.

［7］Flaws JA, Doerr JK, Sipes IG, et al. Destruction of preantral follicles in adul trats by 4-vinyl-1-cyclohexene diepoxide [J]. Reprod Toxicol,1994, 8(6):509-514.

［8］高慧，楊涓，韓冰，等.藥物型卵巢早衰動物模型的研究[J].國醫(yī)論壇, 2007, 22(3):22-26.

［9］吳克明，張黎鵬，王家葵，等.雷公藤多甙致雌性小鼠生殖損傷模型治療時機(jī)研究[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2008, 31(2):27-28.

［10］管雁丞，羅頌平，倪張俊. 天癸失序藥源性卵巢功能損傷大鼠模型差異性研究[J].中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30(7):2 374- 2 377.

［11］Yang L, Chen Q, Wang F, et al. Antiosteoporotic compounds from seeds of Cuscuta chinensis [J]. J Ethnopharmacol, 2011, 135(2):553-560.

［12］舒翔, 胡曉鵑, 周圣煜, 等. 槲皮素對幼鼠卵巢發(fā)育以及血液中激素水平的影響[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2011, 46(9):1 051-1 057.