染料木黃酮通過PI3K/AKT途徑抑制雄激素非依賴性LNCaP細胞

曹玉霖，李 飛，趙 歡，歐 愚，張薇薇，朱彥鋒

前列腺癌是男性生殖系常見的惡性腫瘤之一，在西方國家發病率僅次于肺癌，是第二位的男性癌癥致死病因[1]。前列腺癌的發生、進展依賴于雄激素，目前雄激素剝奪治療是前列腺癌患者的一線治療方法，雄激素剝奪治療在前列腺癌早期有效，但大多數患者在治療14～30個月后便進入“去勢抵抗”階段，發展為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer, CRPC)[2]，傳統的化學治療對CRPC療效欠佳，其平均生存期僅為2～3年。前列腺癌向去勢抵抗性前列腺癌轉變的機制目前尚不清楚。

染料木黃酮(Genistein, GEN)是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于豆莢類植物中，是一種天然植物雌激素，有確切預防癌癥的作用[3]。研究[4-5]顯示，通過膳食攝入的GEN可以預防和治療相關疾病，特別是對乳腺癌、前列腺癌有積極的預防和治療作用。大量研究證實，GEN有抗前列腺癌活性，主要表現在抑制腫瘤細胞增殖[6-7]、誘導細胞凋亡[8]、抑制腫瘤血管形成[9]，以及對抗癌藥物的協同增敏作用。GEN還能降低早期前列腺癌患者血清前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)水平[10]。目前，關于GEN治療前列腺癌后期的CRPC的發生和發展的作用及機制研究較少。該研究旨在探討GEN對雄激素非依賴性LNCaP細胞的抑制作用。通過建立雄激素非依賴性LNCaP細胞的模型,在體外模擬雄激素依賴性前列腺癌進展為雄激素非依賴性前列腺癌的過程。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑LNCaP細胞(成都哈里生物公司)；無酚紅RPMI-1640培養液(以色列Biological Industries公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；GEN、DMSO(美國Sigma公司)；CCK-8(南京凱基公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天公司)；兔抗人PSA、兔抗人P53、兔抗人增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、兔抗人細胞周期蛋白(CyclinD1)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)、p-PI3K蛋白、絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、p-AKT蛋白抗體(美國Abcam公司)；山羊抗兔IgG、鼠抗人β-actin及山羊抗鼠IgG單克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1雄激素非依賴性前列腺癌LNCaP細胞株的建立 雄激素依賴性LNCaP細胞用常規含10%胎牛血清的無酚紅RPMI 1640培養基培養，經3周傳代3次后，血清改用經活性碳/葡聚糖處理的胎牛血清，平均每3 d換液1次，每6 d傳代1次，連續傳代40次共8個月。培養環境為37 ℃、5% CO2常規培養箱。

1.2.2CCK-8檢測雄激素非依賴性LNCaP細胞生長情況 在96孔板中接種處于對數生長期的雄激素非依賴性LNCaP細胞，每孔培養5 000個細胞。5% CO2、37 ℃孵育，孵育24 h后，去掉舊培養液，每孔加入不同濃度的GEN工作液100 μl (7個濃度組: 0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)，每個濃度組設5個復孔。GEN 0 μmol/L組為對照組。孵育24、48、72 h 后，每孔再加入100 μl含10% CCK-8的培養液，孵育4 h。用酶標儀檢測450 nm處的吸光度(optical density,OD)。根據公式: 抑制率(%)= (1-加藥組OD/對照組OD)×100%，計算不同濃度組GEN對雄激素非依賴性LNCaP細胞的抑制率。

1.2.3Western blot法檢測蛋白的表達 6個濃度組的GEN處理LNCaP細胞72 h后，加入蛋白酶抑制劑和裂解液的混合物，在冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，用BCA法對上清液進行蛋白定量并分裝保存于-70 ℃。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，利用80 V(濃縮膠) /120 V(分離膠) 電壓對蛋白質進行分離，在100 V 恒壓條件下轉移1.5 h。PVDF膜用TBST沖洗并浸入5%脫脂牛奶中封閉，振蕩1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，分別加入兔抗人PSA、兔抗人PCNA、兔抗人Cyclin D1、兔抗人P53、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT單克隆抗體(1 ∶1 000)，搖床4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。加入HRP標記的羊抗兔IgG (1 ∶5 000)，室溫下孵育1.5 h。TBST洗膜3次，每次10 min。通過凝膠成像儀對PVDF膜進行曝光成像，以目的蛋白與內參β-actin的光密度比值評價其表達。重復實驗3次。

2 結果

2.1雄激素非依賴性LNCaP細胞模型的建立正常LNCaP細胞用常規培養基培養，傳代3次后，改用無激素無酚紅培養基培養，連續傳代40次。在活性碳/葡聚糖處理的胎牛血清的RPMI 1640培養液中，雄激素非依賴性LNCaP細胞呈梭形貼壁生長，培養3 d后，細胞開始向外伸出許多突觸，培養7 d后，細胞長至80%。正常LNCaP細胞和雄激素非依賴性LNCaP細胞在40倍顯微鏡下的形態見圖1。

圖1 雄激素依賴性和雄激素非依賴性LNCaP細胞在顯微鏡下形態 ×40

A:雄激素依賴性LNCaP細胞；B：雄激素非依賴性LNCaP細胞培養40代后

2.2雄激素非依賴性LNCaP細胞模型的驗證正常LNCaP細胞、LNCaP細胞去激素培養20代、40代后，利用Western blot法檢測PSA蛋白的表達，用凝膠成像儀分析電泳結果，圖2顯示LNCaP細胞內PSA的表達水平隨著去激素培養代數的增加而逐漸降低。

圖2 正常LNCaP細胞、LNCaP細胞去激素培養20代、40代的PSA表達水平

2.3GEN對雄激素依賴性LNCaP和雄激素非依賴性LNCaP細胞增殖的影響CCK-8法檢測不同濃度的GEN(0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L) 分別作用于雄激素依賴性LNCaP細胞和雄激素非依賴性LNCaP細胞24、48、72 h后的增殖影響。結果顯示:GEN作用于雄激素依賴性LNCaP細胞和雄激素非依賴性LNCaP細胞后，對其增殖具有明顯的抑制作用，且具有劑量、時間依賴關系(P<0.05)。見表1、2。

表1 不同濃度GEN對雄激素依賴性LNCaP細胞體外增殖的影響

與對照組比較：*P<0.05

表2 不同濃度GEN(μmol/L)對雄激素非依賴性LNCaP細胞體外增殖的影響

與對照組比較：*P<0.05

2.4不同濃度GEN對雄激素非依賴性LNCaP細胞周期蛋白的影響GEN 處理雄激素非依賴性LNCaP細胞72 h后，Western blot法檢測結果顯示，GEN能上調LNCaP細胞中P53的表達，下調了增殖抗原PCNA及周期蛋白CyclinD1的表達。見圖3。

圖3 不同濃度GEN處理72 h對PCNA、CyclinD1、P53表達的影響

2.5對PI3K/AKT信號通路的抑制作用為了進一步探討GEN抑制LNCaP生長的分子機制，檢測了PI3K/AKT信號通路的表達，結果顯示，100 μmol/L的GEN和陰性對照組(0 μmol/L GEN)處理雄激素非依賴性LNCaP細胞48 h后,PI3K和AKT的磷酸化明顯受到抑制，見圖4。

3 討論

CRPC是前列腺癌終末期的表現，大多數患者最終會對現有的常規抗腫瘤化療藥物產生抗性而失效，因此，如何延緩CRPC的產生是當前治療前列腺癌的重點之一。大量研究[11-12]表明，大豆異黃酮能夠抑制前列腺癌細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制癌細胞侵襲轉移等抗腫瘤效應，對預防和治療前列腺癌具有重要意義。但大豆異黃酮對前列腺癌治療后期的CRPC的發生和發展的作用及機制研究較少。

圖4 100 μmol/L的GEN處理48 h對PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT表達的影響A：陰性對照組；B：100 μmol/L GEN

本研究中采用了CRPC代表細胞株LNCaP作為實驗株，在體外建立了雄激素非依賴性生長的細胞模型。研究GEN對雄激素非依賴性LNCaP細胞增殖與凋亡的影響并探討其作用機制。

CCK-8法提示，隨著GEN濃度的增高，LNCaP細胞和雄激素非依賴性LNCaP細胞的生長有明顯的抑制作用，且呈現出時間、劑量依賴關系。

Cyclin D1的過度表達會改變細胞周期進程。研究[13]顯示GEN抑制22RV1細胞增殖可能是通過下調CyclinD1的表達來實現。Cyclin D1 基因過表達和基因擴增在多種腫瘤細胞中被發現。本研究顯示GEN濃度大于25 μmol/L時可顯著抑制LNCaP細胞中CyclinD1蛋白的表達。

腫瘤細胞的增殖活性旺盛，PCNA可作為評價腫瘤細胞增殖狀態的指標，隨著細胞增殖周期的不同，其含量發生相應的變化。p53是一種腫瘤抑制基因，50%以上的惡性腫瘤會出現該基因的突變。本研究通過Western blot實驗檢測發現GEN能抑制CRPC細胞中PCNA表達，而上調P53蛋白的表達，這提示GEN能夠抑制CRPC細胞的增殖。Zhao et al[14]研究發現GEN在10 μmol/L時能上調P53的表達，阻滯LNCaP細胞在G2/M 期，與本研究作用濃度(12.5 μmol/L) 相符。

PI3K/AKT信號通路參與增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節[15]，目前以PI3K-AKT信號通路關鍵分子為靶點的腫瘤治療策略正在發展中。Western blot結果顯示，100 μmol/L的GEN處理雄激素非依賴性LNCaP細胞48 h后，PI3K和AKT的磷酸化明顯受到抑制，而PI3K和AKT的總蛋白水平沒有明顯變化。說明GEN處理雄激素非依賴性LNCaP細胞后，抑制細胞增殖，可能與其下調PI3K和AKT磷酸化水平，抑制PI3K/AKT信號通路有關，但仍需進一步實驗證實。

本研究建立了雄激素非依賴性LNCaP細胞的體外生長模型，結果顯示GEN可以顯著抑制雄激素非依賴性LNCaP細胞的生長，并能下調Cyclin D1、PCNA的表達。GEN抑制雄激素非依賴性LNCaP細胞的增殖，其作用機制與下調PI3K/AKT信號通路有關。本研究證實了染料木黃酮對CRPC的“化學預防”作用。

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