肝細胞生長因子在原發性開角型青光眼視神經損傷中的作用及機制研究

劉 超，陶黎明，梁 坤，蔣正軒，張康玉，劉賀婷

青光眼是世界上第二大視力障礙和失明的原因，全球患病率為3.54%，2040年可能超過1億人[1]。青光眼以視盤凹陷和視野下降為特征，升高的眼內壓被認為是危險因素中最關鍵的機制；眼壓升高導致細胞外基質板的變形或彎曲，從而通過機械應力損傷軸突并最終導致視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell, RGC)死亡[2]。盡管在青光眼中已經鑒定了許多細胞或分子與之有關，但確切的發病機制仍然是未知的。肝細胞生長因子(hematopoietic growth factor, HGF)是一種間質來源的多效生長因子，在多種組織細胞中發揮多種功能包括遷移、增殖和分化[3]，對于眼的損傷修復和相關疾病有著重要的關系；HGF存在于多種組織中，在眼部可由成纖維細胞、血管平滑肌細胞、角膜上皮細胞、晶狀體上皮細胞、虹膜和視網膜色素上皮細胞產生。HGF可在視網膜缺血再灌注損傷和視網膜色素上皮細胞的傷口愈合中起著神經保護作用。該研究通過TUNEL染色檢測慢性高眼壓HGF注射組大鼠視網膜神經節細胞的凋亡并與慢性高眼壓和正常對照組做比較；其次檢測與凋亡相關的Akt信號通路中Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表達情況，初步探討HGF在青光眼中的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物分組和慢性高眼壓模型的建立 普通級SD大鼠45只，雌性，180～210 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。隨機分成3組：正常對照組(n=15)、慢性高眼壓組(n=15)、慢性高眼壓HGF注射組(n=15)。造模前用裂隙燈檢查所有大鼠雙眼，排除眼部疾病。按Shareef et al[4]方法，右眼用手持式眼科燒灼器灼燒3條鞏膜上靜脈(位于上直肌附近的兩個背側鞏膜上靜脈和位于外直肌附近的一個顳側鞏膜上靜脈)；對側對照眼采用假手術治療，僅分離出3條靜脈，但無燒灼；術后左氧氟沙星眼藥水點眼，每天4次，維持3 d。

1.1.2藥物和試劑 左氧氟沙星滴眼液購自中國參天制藥株式會社公司；HGF購自武漢博士得生物有限公司；SABC免疫組化檢測試劑盒、檢測原位細胞凋亡TUNEL試劑盒和濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森科技有限公司；間質表皮轉化因子(tyrosine-protein kinase met, c-met)抗體、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phospho-protein kinase B, p-Akt)、B細胞淋巴瘤基因-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)和抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病-xl(B-cell lymphoma/leukemia-xl, Bcl-xl)抗體均購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1HGF玻璃體中注射 慢性高眼壓HGF注射組鞏膜上靜脈燒灼術后立即使用Hamilton精確注射器在角膜鞏膜連接處刺入大鼠眼內，待針頭進入玻璃體，向玻璃體內緩慢注射HGF 4 μl(1 μg/μl)，停留片刻后拔出注射器并用無菌棉簽按壓穿刺口5 min，小心不要刺破晶狀體。

1.2.2眼壓測量 使用iCare壓平眼壓計測量眼壓，包括術前、術后即刻、術后第1 d、術后第3天、術后1周和術后2周。據文獻[5]報道，正常的大鼠眼壓是1.33～1.87 kPa，在本次實驗中，從每只眼睛獲得3個連續讀數，取其平均值作為該眼眼壓值，當模型眼眼壓中平均眼壓小于1.4倍或大于2.8倍時，排除該大鼠。

1.2.3樣本的采集和保存 實驗中分別于術前、術后1 d、術后1周、術后2周抽取房水25 μl，房水中無滲出、出血和細胞等；立即離心，10 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存，用于ELISA實驗。術后2周處死大鼠，3組大鼠每組中隨機抽取10只大鼠，取出眼球于10%福爾馬林固定后制備石蠟切片，隨機抽取其中5只大鼠用于免疫組化，另外5只大鼠用于TUNEL染色；剩下的每組5只大鼠取出眼球在顯微鏡下水中分離出視網膜，吸去多余的水分，液氮速凍后快速轉入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白提取。

1.2.4房水HGF水平檢測 所有試驗在室溫下按ELISA試劑盒說明書操作:96孔板中每孔加入150 μl分析稀釋 RD1W 150 μl,加入校準稀釋 RD5P(1×)標準液或樣本50 μl,室溫孵育2 h,洗滌,重復3次,加HGF結合劑200 μl,室溫孵育2 h,洗滌,重復3次,加底物200 μl,室溫孵育30 min,加終止液50 μl,用酶標儀450 nm及595 nm處檢測光密度(optical density, OD)值,根據標準曲線,檢測儀統計軟件自動計算測定值；均重復3孔，測量后取平均值。

1.2.5細胞凋亡和TUNEL染色 TUNEL染色步驟：石蠟包埋的組織切片按常規方法脫蠟至水；PBS漂洗3次，每次5 min；加入蛋白酶K工作液，37 ℃反應15～30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；室溫固定15～30 min；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入封閉液中，室溫封閉10 min，PBS漂洗3次，每次5 min；進行標記反應。在光學顯微鏡下進行觀察，每張切片隨機選取3個視野，每個視野觀察神經節細胞層被染成棕褐色的細胞并計數，取3個視野染色細胞計數的平均值作為細胞凋亡數。

1.2.6免疫組化觀察c-met在大鼠視網膜中的表達情況 組織制備同TUNEL；血清封閉液封閉孵育30 min；c-met一抗孵育(10%PBS配，滴度1 ∶500)4 ℃過夜，二抗工作液(滴度1 ∶200)室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，脫水，中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察結果并拍攝圖片，c-met在圖片中顯色為紅棕色-棕色。

1.2.7蛋白質提取及Western blot檢測 蛋白質提取：取1 mg組織，加入0.2 ml RIPA裂解液，勻漿器充分勻漿后離心取上清液；BCA法測定蛋白濃度。Western blot檢測步驟：根據實驗需要稀釋蛋白，100 ℃變性10 min，將等量的視網膜提取物(15 μl蛋白質)加載到SDS-PAGE上，分離蛋白質；然后將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉封閉膜，然后在4 ℃下對PI3K、Akt、pPI3K和pAkt抗體(1 ∶1 000稀釋)孵育12 h；洗滌后，膜在20 ℃下與適當的二抗[辣根過氧化物酶(HRP)，1 ∶5 000稀釋]孵育1 h；ECL顯色試劑盒顯色30 s，電腦分析軟件成像，Image J對所得條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1房水HGF的水平不同時期大鼠眼前房水 HGF濃度見表1，術前慢性高眼壓眼和對照眼前房水HGF濃度分別是(301.6±73.8)、(312.8±79.3) pg/ml,術后即刻慢性高眼壓眼和對照眼前房水HGF濃度分別是(312.7±80.3)、(320.6±86.7) pg/ml；術前和術后即刻房水濃度差異無統計學意義(P>0.05)。在高眼壓的第 1、3、7、14天,房水中HGF濃度顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2視網膜神經節細胞凋亡情況TUNEL染色陽性的細胞呈棕褐色，正常對照組神經節細胞層中只有少數的細胞TUNEL染色呈陽性；正常對照組、慢性高眼壓組和慢性高眼壓HGF注射組的神經節細胞層TUNEL染色陽性細胞數分別是(1.67±0.15)、(16.56±2.78)、(5.23±0.81)；與正常對照組比較，慢性高眼壓組神經節細胞染色呈陽性的細胞數明顯增多(P<0.05)；與慢性高眼壓組比較，慢性高眼壓HGF注射組神經節細胞染色呈陽性的細胞數明顯下降(P<0.05)，見圖1。

表1 慢性高眼壓組大鼠前房HGF水平

2.3HGF受體c-met在視網膜中的表達定位免疫組化分析顯示，在正常對照組、慢性高眼壓組和慢性高眼壓HGF注射組c-met主要在視神經細胞層表達，見圖2。

2.4p-Akt、Bcl-2和Bcl-xl蛋白在視網膜中的表達情況Western blot結果顯示，以β-actin為內參，HGF玻璃體腔注射14 d后，與慢性高眼壓組比較，慢性高眼壓HGF注射組中p-Akt表達明顯上調；同時慢性高眼壓HGF注射組中Bcl-2和Bcl-xl表達量明顯高于慢性高眼壓，見圖3。以上說明HGF可激活Akt信號通路而抑制視網膜神經節細胞的凋亡。

圖1 大鼠視網膜神經節細胞層 TUNEL染色×400

圖2 術后2周免疫組化檢測c-met在視網膜中的表達位置 ×400

圖3 Western blot法檢測蛋白表達情況

1：正常對照組；2：慢性高眼壓組；3：慢性高眼壓HGF注射組；與正常對照組比較：#P<0.05；與慢性高眼壓組比較：※P<0.05

3 討論

青光眼是一組因病理性眼壓升高而致視神經損失，表現為視野進行性缺損的疾病，是目前世界上首位不可逆性致盲眼病，嚴重危害患者視力。青光眼的發病機制目前尚未完全清楚，治療手段僅限于降眼壓，但不能阻止視野的進行性丟失，因而成為眼科臨床亟須解決的難題。在本研究中，檢查了HGF對青光眼誘導的RGC凋亡的影響。本研究表明，HGF可以阻止高眼壓誘導RGC的凋亡，并且RGC的凋亡明顯低于慢性高眼壓組；此外，HGF可上調Akt信號通路中的抗凋亡因子，如Bcl-2和Bcl-xl。

HGF是一種多效生長因子，可刺激各種上皮細胞的生長、侵襲，新生血管形成和細胞轉移[6]。HGF在響應細胞或組織損傷中起重要作用，如在視網膜缺血再灌注損傷和視網膜色素上皮細胞的傷口愈合中起著神經保護作用[7]，同時有利于維持視神經損傷后的神經節細胞長期存活和對有利刺激的反應傾向[8]，此外HGF可以防止血清戒斷后小腦神經元的凋亡[9]。

為了證實HGF與RGC凋亡之間的關系，本研究通過TUNEL染色來量化RGC凋亡。與慢性高眼壓組相比，慢性高眼壓HGF注射組RGC凋亡率顯著降低；慢性高眼壓組玻璃腔注射HGF的抗凋亡作用得到了神經節細胞層中TUNEL染色陽性細胞減少的支持；慢性高眼壓組注射HGF后RGC存活率顯著提高，提示玻璃體腔內注射HGF可起到高眼壓的神經保護作用。

c-met存在于視網膜神經節細胞中已經在嚙齒動物視網膜的研究中得到證實[10]。 本研究結果顯示正常對照組、慢性高眼壓組和慢性高眼壓HGF注射組的視網膜神經節細胞均表達c-met。c-met受體是生長因子受體，該受體屬于酪氨酸激酶家族；當HGF與之結合后，c-Met受體被激活[11]，然后酪氨酸激酶結構域的活化環中的酪氨酸殘基上c-met發生自身磷酸化導致c-met位點被激活，c-met位點激活后可募集細胞內作為信號轉導分子的銜接蛋白，這些分子包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和生長因子受體結合蛋白1和2，然后調控下游信號傳導。以往的研究[12]顯示，PI3K藥理學上的抑制作用阻止了HGF誘導的Akt磷酸化，消除了成年頸神經節神經元的存活反應，表明PI3K信號通路在介導HGF抗凋亡作用中起關鍵作用。Akt通路是參與細胞增殖與分化調節的重要信號轉導通路；目前認為其對細胞凋亡具有重要的調節作用，可影響其信號通路下游 Bcl-2家族成員中的Bcl-2和Bcl-xl的活性，抑制線粒體釋放凋亡因子及細胞色素c，發揮抗凋亡作用[13]。本研究顯示，與正常組比較，慢性高眼壓組 p-Akt、Bcl-2和Bcl-xl表達水平顯著降低；與慢性高眼壓組比較，慢性高眼壓HGF注射組p-Akt、Bcl-2和Bcl-xl表達水平顯著升高。因此，HGF對高眼壓誘導視網膜神經節細胞凋亡的抑制作用可能與其激活Akt 信號通路以及其下游的Bcl-2和Bcl-xl表達增多有關。

綜上所述，本研究結果表明玻璃體內注射HGF可能通過激活Akt信號通路以及增加其下游Bcl-2和Bcl-xl抗凋亡蛋白的表達而發揮對慢性高眼壓視神經的保護作用；因此，HGF有望成為阻止青光眼視網膜神經節細胞凋亡的一種潛在治療方式。

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