利拉魯肽對肥胖相關性腎病的作用以及與自噬通路的關系

李 娜，郭晶晶，霍琴琴，潘天榮，鐘 興

肥胖相關性腎病(obesity-related glomerulopathy，ORG)是由于肥胖引起機體一系列代謝問題，并由此導致的腎臟病變。利拉魯肽為胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)類似物，與天然的GLP-1有97%的同源性，具備GLP-1全部生理作用[1]。研究[2]顯示GLP-1能保護腎臟、減輕糖尿病腎病患者蛋白尿癥狀，延緩糖尿病腎病的進展，但是對于ORG的作用，目前尚不明確。自噬是真核細胞內的蛋白質大分子、細胞器等在自噬溶酶體的作用下被降解的過程。通過研究特異性足細胞Atg5基因敲除小鼠顯示，自噬可以保護腎臟并且減少蛋白尿的產生[3]。該研究通過觀察ORG小鼠模型的腎臟病理學、血清學指標和尿微量白蛋白，評價利拉魯肽對ORG的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6J雄性小鼠34只，(19.04±0.37)g，購自南京大學-南京生物醫藥研究所。隨機分為正常對照組12只，高脂組22只。

1.1.2主要藥物、器材與試劑 利拉魯肽(商品名諾和力)購自丹麥諾和諾德公司(批號：FP51752-2)；ELISA測定試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；Western blot試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；ADVIA 2400全自動生化分析儀購自德國西門子公司。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型的建立 小鼠適應性喂養10 d后，隨機分為正常對照組12只，高脂組22只，正常對照組予以普通飼料喂養，高脂組予以高脂飼料喂養，高脂飼料配方為豬油6%，膽固醇2%，蛋黃粉10%，膽鹽0.2%，基礎飼料81.1%，購自江蘇省協同生物工程有限責任公司。高脂喂養12周后，在高脂組及正常對照組隨機各選取2只小鼠處死，腎臟病理提示高脂組造模成功，將高脂組隨機分為利拉魯肽組10只及肥胖組10只，并繼續予以高脂飲食，利拉魯肽組予以皮下注射利拉魯肽0.6 mg/(kg·d)，肥胖組予以生理鹽水0.6 mg/(kg·d)，每周測量小鼠體質量，根據體質量變化調整藥物劑量，干預12周，期間正常對照組一直予以普通飼料喂養，各組小鼠自由進食水，標準鼠籠飼養，每籠4～5只，溫度在20～25 ℃，12/12 h光照黑暗循環(光照時間7:00-19:00)。

1.2.2標本采集 使用小鼠代謝籠收集小鼠24 h尿液，記尿量，離心后取上清液測小鼠24 h尿微量白蛋白。干預至12周末，稱取小鼠體質量，內眥取血，離心后取上清液，將小鼠斷頭處死，迅速取出雙側腎臟，觀察雙腎大小形態，稱取右腎濕重后，切取部分組織用10%的中性福爾馬林固定，行石蠟包埋切片，用于HE等染色，余腎臟組織放置-80 ℃冰箱，用于Western blot實驗。

1.2.3指標測定 采用HE、PAS染色觀察腎臟病理變化；采用ELISA測定小鼠尿微量白蛋白；采用全自動生化分析儀測定小鼠血脂，包括膽固醇(cholesterol，CHO)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low densith lipoprotein，LDL)；采用Western blot法測定小鼠腎臟組織的自噬通路相關因子沉默信息調節因子1(silent information regulator 2，SIRT-1)和AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)、微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein1 light chain 3, LC3)，以及自噬活性標志物泛素結合蛋白P62的表達。

2 結果

2.1小鼠體質量、右腎濕重及24h尿微量白蛋白變化與正常對照組相比，肥胖組小鼠體質量明顯增加，而在利拉魯肽干預12周后，小鼠體質量較肥胖組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與正常對照組相比，肥胖組小鼠尿微量白蛋白明顯升高，利拉魯肽干預12周后尿微量白蛋白較肥胖組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組小鼠血TG、CHO和LDL的變化肥胖組TG、CHO、LDL較正常對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；利拉魯肽干預12周后，TG、CHO、LDL較肥胖組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 各組小鼠24 h尿白蛋白、體質量及右腎濕重的變化

與正常對照組比較：*P<0.05，與肥胖組比較：#P<0.05

表2 各組小鼠血清TG、CHO、LDL變化

與正常對照組比較：*P<0.05，與肥胖組比較：#P<0.05

2.3各組小鼠腎臟組織病理變化小鼠腎臟HE及PAS染色顯示，與正常對照組小鼠相比，肥胖組小鼠腎臟腎小球肥大、系膜基質增多顯著，伴有局灶節段性硬化，而在利拉魯肽干預12周后，腎小球肥大、局灶節段性硬化及系膜基質增多明顯改善，見圖1。

2.4各組小鼠腎臟自噬通路相關因子SIRT-1、P-AMPK、LC3B、P62蛋白含量比較Western blot法檢測結果顯示，與正常對照組相比，肥胖組SIRT-1、P-AMPK/AMPK、LC3B含量明顯下降，P62含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與肥胖組相比，利拉魯肽組SIRT-1、P-AMPK、LC3B含量明顯上升，而P62含量下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

3 討論

隨著經濟水平的快速發展和生活方式的改變，肥胖的發病率日益增加，肥胖可對包括腎臟在內的多個重要器官造成病理損害[4]。Bonnet et al[5]報道了162例IgA腎病患者20年隨訪，腎活檢時發現在BMI≥25kg/m2的患者中，腎病理改變及腎功能惡化更明顯。肥胖的流行導致ORG流行性大幅度增加，ORG早期表現為腎小球濾過率增加及微量白蛋白尿，隨著病情進展可出現不同程度蛋白尿，最終可發展為腎功能不全。ORG主要的組織學特點包括腎小球肥大伴或不伴腎小球局灶節段性硬化，系膜基質增加及系膜細胞增殖等[6]。

2001年首次公開利拉魯肽的動物實驗結果，顯示給肥胖大鼠模型注射利拉魯肽可有效減輕肥胖個體的體質量[7]。研究[8]表明，在利拉魯肽干預治療4周后，大鼠血清TG、CHO水平明顯下降。與上述研究結果一致，本研究也顯示，在肥胖組中，小鼠體質量、右腎濕重及血清TG、CHO、LD指標均明顯升高，利拉魯肽干預12周后，小鼠體質量、右腎濕重及血脂水平較肥胖組均顯著下降。一項564例肥胖患者的雙盲、隨機對照研究[9]表明，利拉魯肽能顯著降低肥胖患者的體質量。

動物模型研究[10]顯示，GLP-1受體激動劑可有效改善糖尿病大鼠的腎小球肥大，系膜增生及腎小球硬化。本研究在ORG小鼠模型中也觀察到，在肥胖組小鼠中，腎臟出現明顯的腎小球肥大，伴有局灶節段性硬化，系膜基質增多，肥胖組小鼠24 h尿微量白蛋白明顯升高，而在利拉魯肽干預12周后，小鼠腎臟病理變化及24 h尿微量白蛋白均明顯改善。提示利拉魯肽對ORG有顯著的改善。

圖1 各組小鼠腎臟組織病理變化 ×400

圖2 各組小鼠腎臟組織自噬相關蛋白變化

A：P-AMPK/AMPK ;B:LC3B;C:P62;D:SIRT-1;1:正常對照組;2:肥胖組;3:利拉魯肽組;與正常對照組比較：*P<0.05;與肥胖組比較：#P<0.05

自噬在清除廢物，結構重建，細胞生長發育，蛋白代謝平衡維持和細胞內環境穩定中有重要作用[11]。自噬可受營養感受信號如SIRT-1、mTOR和AMPK的調節。目前有多項研究[12]顯示，SIRT-1與AMPK關系密切，白藜蘆醇通過SIRT-1刺激AMPK，改善線粒體功能，SIRT-1/AMPK是自噬的經典通路。AMPK是自噬的上游調節因子，AMPK的喪失導致自噬缺陷[13]；微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是一種自噬相關蛋白，有LC3I和LC3II(LC3B)兩個亞型；與LC3I相比，LC3II定位于自噬泡膜上，對于評價自噬活性更為敏感。P62是自噬的另一種相關蛋白，當自噬低或缺乏時，會發生P62聚集的積累[14]。腎小球足細胞在生理狀態下就有較高水平的自噬，自噬抑制劑或敲除自噬相關基因的足細胞的濾過功能降低[15]。相關研究[16]顯示在高脂誘導的小鼠肝臟中，GLP-1受體激動劑艾塞那肽通過上調SIRT-1和AMPK磷酸化而改善脂肪肝，在腎臟組織中，GLP-1受體激動劑發揮作用是否與SIRT-1/AMPK通路有關尚不清楚。本研究顯示，與正常對照組相比，肥胖小鼠的腎臟中自噬通路蛋白SIRT-1、P-AMPK以及LC3B蛋白明顯下降，而P62蛋白的累積明顯增多，提示在肥胖小鼠中，自噬活性明顯降低；而在利拉魯肽干預12周后，腎臟自噬通路蛋白SIRT-1、P-AMPK以及LC3B明顯升高，P62的累積明顯下降，提示利拉魯肽保護ORG的腎臟，機制可能與改善腎臟的自噬活性有關。

綜上所述，從血清學、尿液學檢查、腎臟病理學檢查及Western blot檢測得出，GLP-1受體激動劑利拉魯肽能夠改善ORG微量蛋白尿和腎臟病理改變，可能與誘導ORG小鼠的自噬活性增加有關，利拉魯肽有可能成為治療ORG患者的新型藥物。

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