miR-30b-5p抑制膽固醇合成和結直腸癌細胞增殖

張亞珍，何貴省，吳曉明，宋杰峰，吳煌福

結直腸癌是最常見和致死率最高的惡性腫瘤之一[1-2]。研究[3-4]顯示microRNA在結直腸癌中扮演著抑癌或致癌作用。膽固醇代謝在近年來受到了廣泛關注，它對結直腸癌的發生發展十分關鍵[5]。低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor, LDLR)是調節膽固醇代謝的重要分子，在腫瘤中的作用也被廣泛報道[6-7]。該研究首先檢測結直腸癌組織及患者血清中miR-30b-5p的表達量，通過過表達或敲低miR-30b-5p判定其在結直腸癌中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 結直腸癌細胞系Caco-2、HT-29及HCT-116均購自ATCC(American Type Culture Collection)；人正常結腸上皮細胞NCM460購自上海蓋寧生物公司。12對結直腸癌組織和癌旁組織及11個結直腸癌患者血液樣本和正常人血液樣本均來自于海南醫學院第二附屬醫院，并獲得知情同意書。

1.1.2試劑 Cholesteryl Ester Quantitation試劑盒、β-actin抗體(英國Abcam公司)；LDLR抗體(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM培養基及胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；TRIzol、LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；ReverTra Ace qPCR RT Kit(日本TOYOBO公司)；TransStart SYBR Green qPCR SuperMix (中國全式金公司)；RNA酶抑制劑和RNA酶 free water(美國Promega公司)。

1.1.3RNA試劑 miR-30b-5p mimics和mimics control，miR-30b-5p inhibitor和inhibitor control(廣州銳博公司)。LDLR的siRNA由上海GenePharma公司合成。miR-30b-5p mimics：UGUAAACAUCCUACACUCAGCU；miR-30b-5p inhibitor：ACAUUUGUAGGAUGUGAGUCGA；siLDLR：GCGACAGAUGCGAAA GAAAdTdT。

1.2方法

1.2.1細胞培養 Caco-2、HT-29、HCT-116及NCM460均用DMEM完全培養基培養，包含10%胎牛血清、1%的青鏈霉素混合液和89%的DMEM培養基。細胞放置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2細胞轉染 將miR-30b-5p inhibitors及陰性對照inhibitors control和miR-30b-5p mimics及陰性對照mimics control的干粉用一定量的RNase水溶解。將HT-29和HCT-116細胞鋪在6孔板中，待細胞貼壁后，5 μl的Lipofectamine 2000加入到500 μl無血清DMEM培養基中, 5 nmol/L濃度的 miR-27a mimic和miR-27a inhibitor及其陰性對照溶液加入到500 μl無血清DMEM培養基中，輕輕吹打混勻后室溫靜置5 min。將以上兩種液體混勻后室溫靜置20 min。將混合液加入6孔板的細胞中，置于含5% CO2的37 ℃孵箱中培養，6 h后更換DMEM完全培養基。LDLR的siRNA轉染按照銳博生物科技有限公司的方法操作。

1.2.3總RNA提取和qRT-PCR 用TRIzol裂解細胞或組織，RNA提取試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)用于總RNA的提取，血液RNA使用miRNeasy Serum/Plasma kit[德國凱杰(QIAGEN)公司]試劑盒提取。去基因組逆轉錄試劑盒[日本東洋紡(TOYOBO)生物科技有限公司]用于RNA逆轉錄，使用北京全式金生物技術有限公司的SYBR Green qPCR SuperMix進行qRT-PCR反應，具體操作詳見說明書。逆轉錄及qRT-PCR引物見表1。

1.2.4蛋白提取和Western blot 蛋白裂解液(1 g SDS、0.75 g DTT、 3 ml Tris, pH 6.8、5 ml甘油，加水定容至50 ml，一定量溴酚藍)提取細胞蛋白，室溫裂解5 min后，置于98 ℃恒溫金屬浴10 min，12 000 r/min離心5 min，于-20 ℃保存。取50～80 μg蛋白于10%或12%SDS-PAGE凝膠，80 V 0.5 h，100 V 1.5 h，將蛋白轉至PVDF膜上(PVDF膜在甲醇中浸泡10～60 s)，恒流轉膜 1 h 30 min，5%脫脂奶粉(2.5g，50 ml TBST)封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜。第2天孵育相應二抗并應用化學發光儀顯影。

表1 逆轉錄及Real time PCR引物

1.2.5細胞增殖檢測 應用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。將3 000個相應細胞鋪至96孔板，每孔200 μl完全培養基，待4～6 h細胞貼壁設定為0 h。在相應的0、24、48和96 h每孔加入20 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，利用酶標儀檢測450 nm處的吸光值，計算細胞相對活力。

1.3統計學處理mRNA、膽固醇及細胞活力由GraphPad Prism軟件分析。兩組之間的差異比較用t檢驗，多組之間用One-way ANOVA比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1miR-30b-5p水平在結直腸癌組織、血液及細胞中降低與患者的癌旁正常結腸組織相比，結直腸癌組織中的miR-30b-5p表達水平顯著降低(P<0.001)，見圖1A；結直腸癌患者血清中的miR-30b-5p水平明顯低于正常人血清中的miR-30b-5p含量，見圖1B；結直腸癌細胞Caco-2、HT-29及HCT-116中的miR-30b-5p表達量顯著低于正常結腸細胞系NCAM460中的表達量(P<0.05),見圖1C。以上結果表明miR-30b-5p可能是結直腸癌的診斷標志物。

2.2miR-30b-5p抑制結直腸癌細胞的增殖在HT-29細胞中轉入inhibitors control(對照組)或miR-30b-5p inhibitors(實驗組)，HT-29細胞在0和24 h的細胞活性差異無統計學意義；對照組和實驗組細胞在48、72和96 h的細胞活力見圖2A，miR-30b-5p inhibitor增加HT-29細胞48、72和96 h的增殖能力，差異有統計學意義(F=7.75，P<0.05)。相反，在HCT-116細胞中轉入mimics control(對照組)或miR-30b-5p mimics(實驗組)，0和24 h細胞活力差異無統計學意義；對照組和實驗組細胞在48、72和96 h的活力見圖2B，miR-30b-5p mimics抑制HCT-116細胞48、72和96 h的增殖能力，差異有統計學意義(F=14.81，P<0.05)。這些結果說明miR-30b-5p在結直腸癌中起著抑癌作用。

圖1 miR-30b-5p在結直腸癌組織、血清及細胞中的表達情況

A：癌及癌旁組織中miR-30b-5p相對表達量；與癌旁組織比較：***P<0.001；B：正常人及結直腸癌患者血清中的miR-30b-5p表達量；與正常人比較：**P<0.01；C：結直腸及結直腸癌細胞中的miR-30b-5p相對表達量；與NCM460細胞比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 miR-30b-5p對結直腸癌細胞增殖的影響

A：HT-29細胞轉染inhibitors control(對照組)或miR-30b-5p inhibitors(實驗組)的細胞活力曲線圖；B：HCT-116細胞轉染mimics control(對照組)或miR-30b-5p mimics(實驗組)的細胞活力曲線圖；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3miR-30b-5p抑制結直腸癌細胞膽固醇含量在HT-29細胞中轉入inhibitors control(對照組)或miR-30b-5p inhibitors(實驗組)，實驗組的膽固醇水平顯著高于對照組(P<0.01)，見圖3A；相反，在HCT-116細胞中轉入mimics control(對照組)或miR-30b-5p mimics(實驗組)，實驗組的膽固醇含量顯著低于對照組(P<0.01)，見圖3B。

2.4miR-30b-5p抑制結直腸癌細胞LDLR的表達圖4A顯示LDLR的UTR區域能與miR-30b-5p結合；在HT-29細胞中轉入inhibitors control(對照組)或miR-30b-5p inhibitors(實驗組)，對照組和實驗組的LDLR的mRNA相對表達值分別是(1.00±0.052)、(2.88±0.19)，實驗組的LDLR的mRNA和蛋白表達升高(圖4B)；相反，在HCT-116細胞中轉入mimics control(對照組)或miR-30b-5p mimics(實驗組)，對照組和實驗組的LDLR的mRNA分別是(1.00±0.032)、(0.45±0.043)，實驗組的mRNA和蛋白表達被抑制(圖4C)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5敲低LDLR抑制miR-30b-5p沉默的HT-29細胞中膽固醇含量和細胞增殖在轉入miR-30b-5p inhibitor的HT-29細胞中進一步轉染siRNA陰性對照(對照組)和siLDLR(實驗組)后，實驗組膽固醇含量較對照組明顯減少(P<0.01)，見圖5A；對照組和實驗組細胞增殖在24 h差異無統計學意義，在48、72、96 h的細胞數量分別是(183.8±7.2)、(156.1±6.2)，(230.2±8.9)、(184.2±7.1)，(296.4±10.4)、(221.3±6.2)，LDLR敲低的細胞增殖能力被抑制，見圖5B。結果顯示miR-30b-5p通過負調控LDLR表達抑制膽固醇合成和結直腸癌細胞增殖，差異有統計學意義(F=8.95，P<0.05)。

圖3 miR-30b-5p調節結直腸癌細胞膽固醇水平

A：HT-29細胞轉染inhibitors control(對照組)或miR-30b-5p inhibitors(實驗組)的膽固醇含量柱狀圖；B：HCT-116細胞轉染mimics control(對照組)或miR-30b-5p mimics(實驗組)的膽固醇含量柱狀圖；與對照組比較：**P<0.01

圖4 miR-30b-5p負調控LDLR的表達

A：miR-30b-5p結合LDLR的3’UTR區的示意圖；B：HT-29細胞轉染inhibitors control(對照組)或miR-30b-5p inhibitors(實驗組)的LDLR的mRNA和蛋白表達；與對照組比較：***P<0.001；C：HCT-116細胞轉染mimics control(對照組)或miR-30b-5p mimics(實驗組)的LDLR的mRNA和蛋白表達；與對照組比較：***P<0.001

圖5 敲低LDLR對HT-29細胞的膽固醇和細胞增殖的影響

A：LDLR蛋白表達及膽固醇含量柱狀圖；與對照組比較：**P<0.01；B：對照組和實驗組的細胞活力曲線圖；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

microRNA是一種長度約22個核苷酸的不編碼蛋白的短RNA，通過轉錄后水平靶向抑制基因的表達。在很長一段時間里，microRNA被認為是細胞中的垃圾RNA，但是近年來它的功能及作用受到越來越多的關注，研究[8-9]顯示microRNA在各種疾病中起到很重要的作用，其中最被人熟知的就是癌癥，包括結直腸癌。例如，microRNA-184可通過下調C-MYC和BCL-2抑制結直腸癌細胞增殖和促進細胞凋亡[10]。也有研究[11]顯示microRNA-27a通過靶向抑制SFRP1促進結直腸癌的增殖和侵襲。本研究顯示，miR-30b-5p在結直腸癌組織中表達顯著降低，同時在結腸癌患者血清中的含量也減少，與正常結腸上皮細胞相比，miR-30b-5p在結直腸癌細胞中表達下調，提示miR-30b-5p可能在結直腸癌中扮演著抑癌的作用。通過進一步在結直腸癌細胞HT-29中轉入miR-30b-5p的inhibitor，發現細胞增殖能力顯著增強，在HCT-116細胞中轉入miR-30b-5p的mimic，細胞增殖能力降低。這些結果表明miR-30b-5p在結直腸癌中起著抑癌作用，同時也提示它可作為結直腸癌的一個潛在診斷指標。

膽固醇是細胞膜的重要組成成分，對維持膜的完整性和流動性很重要。作為一種脂質分子，膽固醇是合成類固醇激素和膽酸的前體。近年來，膽固醇在腫瘤中的作用被廣泛報道。研究[12]顯示，膽固醇代謝異常可引起肝癌發生；此外，膽固醇在結直腸癌發生發展過程中也起著重要作用。在小鼠飲食中添加膽固醇，可促進AOM誘發的結直腸癌進程，其機制是通過激活NLRP3炎癥體[13]。在本研究中，轉入miR-30b-5p的inhibitor后結直腸癌細胞膽固醇含量升高，相反，在HCT-116細胞中轉入miR-30b-5p的mimic后膽固醇水平降低，提示miR-30b-5p抑制結直腸癌細胞膽固醇的水平。此外，miR-30b-5p沉默后LDLR表達上調，而轉入miR-30b-5p的mimic可抑制LDLR表達，由于LDLR是膽固醇合成通路中的重要酶，miR-30b-5p抑制膽固醇水平可能通過下調LDLR。由于膽固醇合成增多可促進細胞增殖，而miR-30b-5p敲低是否是通過增加膽固醇合成促進細胞增殖。為研究此問題，在轉入miR-30b-5p inhibitor的結直腸癌細胞中進一步敲低膽固醇合成的關鍵酶LDLR，發現不僅膽固醇含量顯著減少，細胞增殖速率也明顯降低，這些結果表明miR-30b-5p沉默可通過上調LDLR的表達增加細胞膽固醇合成，從而促進結直腸癌細胞增殖。

本研究闡明了miR-30b-5p在結直腸癌中的作用。miR-30b-5p的表達在結直腸癌組織、外周血及結直腸癌細胞中降低，通過沉默和過表達方法發現miR-30b-5p在結直腸癌細胞中起著抑癌作用。miR-30b-5p敲低后，LDLR表達和膽固醇含量都增加，而轉入miR-30b-5p的mimic后，兩者都下降；重要的是，在miR-30b-5p敲低的結直腸癌細胞中進一步沉默LDLR可顯著抑制細胞中膽固醇含量和增殖能力。這些結果提示miR-30b-5p是結直腸癌的重要抑癌microRNA，可作為結直腸癌潛在的診斷標志物。

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