胸腺五肽超分子水凝膠的制備及其免疫調節作用研究

任春華，高陽，禇麗萍，劉鑒峰

胸腺五肽是一種人工合成的短肽，來源于含49個氨基酸的促胸腺生成素的第32～36片段，其氨基酸組成為Arg-Lys-Asp-Val-Tyr（RKDVY）。研究證實，RKDVY具有與促胸腺生成素相同的生物活性，能夠通過促進胸腺細胞的分化以及調節成熟T細胞的功能來影響免疫系統［1］。作為一種免疫調節劑，目前RKDVY已經被臨床應用于多種自身免疫性疾病的治療，包括慢性淋巴白血病、過敏性皮炎、類風濕性關節炎以及獲得性免疫缺陷綜合征等［2-4］。但是，由于RKDVY本身較小的分子質量以及極高的水溶性，導致其存在細胞膜滲透性差、半衰期短以及生物利用度低等缺陷［5-6］，從而使其臨床應用受到較大的限制和挑戰。因此，對RKDVY進行合理的結構修飾以提高其穩定性和生物活性具有重要的臨床價值和意義。本研究通過將RKDVY共價修飾到自組裝短肽上，以加熱-冷卻的方法制備RKDVY超分子活性水凝膠，探討其增強細胞攝取及免疫調節作用的效果，以期為RKDVY納米遞送系統的設計及改善其臨床療效提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：三苯基甲基氯樹脂購自天津南開和成科技有限公司；N-9芴甲基羰基（Fmoc）氨基酸及RKDVY購自上海吉爾生化有限公司；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒購自于美國Biolegend公司；小鼠巨噬細胞（RAW 264.7細胞）為本實驗室保存。（2）主要儀器：高效液相色譜儀（HPLC，LC 2000，中國）；液質聯用色譜儀（LC-MS，SHIMADZU 2020系統，日本）；透射電子顯微鏡（TEM，Tecani G2 F20系統，FEI，美國）；流變儀（AR 1500ex，TA，美國）；全波長酶標儀（VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美國）；活細胞工作站（DMI6000B，Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 自組裝多肽（NapGDFDFDYGRKDVY）合成、純化及表征分析 NapGDFDFDYGRKDVY的合成采用經典成熟的Fmoc固相合成法，即每一個氨基酸的氨基都被Fmoc保護著。反應過程中用堿性溶液（哌啶）脫除moc保護基，使之裸露出氨基并與已經活化的下一個氨基酸的羧基交聯縮合，形成肽鍵。反應過程中用苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（O-Benzotriazole-N，N，N'，N'-tetraMethyl-uroniumhexafluorophosphate，HBTU）做為氨基酸羧基的活化劑，用N，N-二異丙基乙胺（N，N-DiisopropylethylaMine，DIEA）做催化劑。不斷重復縮合-洗滌-脫保護-洗滌的過程，使肽鏈從C端向N端依次延長，待肽鏈全部完成時使用三氟乙酸將肽鏈從樹脂上切割下來。經真空減壓旋轉蒸發后除去多余液體，使用無水乙醚沉淀出固體多肽粗品。多肽粗品用二甲基亞砜（DiMethyl sulfoxide，DMSO）溶解后使用高效液相色譜（HPLC）進行分離純化，經冷凍干燥后得到目的多肽純品。通過液質聯用色譜儀（LC-MS）對多肽純品的分子質量和純度進行表征分析。

1.2.2 FITC標記肽的合成、純化及表征分析 異硫氰根FITC（FITC-NCS）上的異硫氰根基團（-NCS）能夠與RKDVY的賴氨酸殘基（K）側鏈上的氨基在堿性條件下發生共價反應，生成FITC標記肽。具體步驟：稱取適量RKDVY及NapGDFDFDYGRKDVY純品并分別溶于少量DMSO中，分別加入等摩爾量的FITC-NCS，用少量三乙胺調節反應溶液的pH值至8.0～9.0，室溫下反應過夜。使用HPLC對反應液進行分離純化，經冷凍干燥后得到FITC標記多肽純品，用LC-MS對多肽純品的分子質量和純度進行表征分析。

1.2.3 胸腺五肽超分子水凝膠的制備及表征分析 稱取2 mg NapGDFDFDYGRKDVY溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，并加入 2～3 mol的碳酸鈉調節pH 為7.4，最終配置成濃度為2 g/L的溶液。用移液器吸取500 μL溶液于玻璃小瓶中，在酒精燈上加熱使其充分溶解后靜置于桌面上，待其冷卻后通過瓶倒置的方法判斷其是否發生了溶液到凝膠的轉變。使用流變儀對其力學性能進行分析測試，使用透射電鏡對其微觀形貌進行表征分析。

1.2.4 細胞攝取實驗 將小鼠RAW 264.7細胞以2×105/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1 mL含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。待細胞全部貼壁且生長狀態良好時，分別加入含有0.02 mmol FITC標記的游離胸腺五肽（RKDVY-FITC）及胸腺五肽納米纖維（NapGDFDFDYGRKDVY-FITC），分別孵育4 h后將孔內液體吸出，用PBS洗3次，用新鮮配置的4%多聚甲醛固定細胞10 min。吸去固定液并用PBS洗3次后，再用5 mg/L的DAPI溶液染細胞5 min，吸去液體后PBS洗2次。置于熒光顯微鏡下通過觀察FITC熒光強度來分析RKDVY-FITC及NapGDFDFDYGRKDVY-FITC的細胞攝取情況。

1.2.5 體外免疫調節實驗 將小鼠RAW 264.7細胞以5×105/孔的密度接種于24孔板中，待細胞生長狀態良好時去除培養基。分別加入含有30 μmol/L的游離RKDVY及NapGDFDFDYGRKDVY的無血清DMEM培養基，每組藥物設立5個平行孔并設立不含藥物的空白對照組。孵育24 h后，收集細胞培養液并在5 000×g轉速下離心5 min以分離出可能含有的細胞碎片。將離心得到的上清液取出后置于冰箱4℃保存。按照TNF-α試劑盒提供的使用說明，通過酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）及已建立的標準曲線測定不同溶液中TNF-α的含量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件行統計學分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NapGDFDFDYGRKDVY合成、純化及表征 自組裝多肽NapGDFDFDYGRKDVY的化學結構如圖1A所示。固相合成1 mmol該多肽可以得到1 200 mg多肽粗品，粗品合成產率達到理想產率的85%以上；合成的100 mg NapGDFDFDYGRKDVY多肽粗品經高效液相色譜分離純化后可以得到83 mg多肽純品，純化產率達到80%以上。純化后的NapGDFDFDYGRKDVY樣品用LC-MS對其純度和分子質量進行分析鑒定，見圖1B：質譜結果顯示為1 421.65，與測算得到的多肽分子質量1 420.58基本相符。色譜圖顯示純化后的多肽產品只有一個峰，純度達到95%以上，符合后續實驗的純度要求。

Fig.1 The chemical structure of NapGDFDFDYGRKDVY(A)and its LCMS spectra(B)圖1 NapGDFDFDYGRKDVY的化學結構（A）及LC-MS譜圖（B）

2.2 FITC標記肽的合成及表征 經HPLC純化后，分別得到了RKDVY-FITC與NapGDFDFDYGRKDVYFITC。純化后的樣品用LC-MS對其純度和分子質量進行分析鑒定，見圖2A，RKDVY-FITC經質譜鑒定后分子質量為1 069，與測算得到的分子質量1 069相符，從色譜峰形可以看出其純度達到95%以上；同樣，NapGDFDFDYGRKDVY-FITC經質譜鑒定后分子質量為1 809（圖2B），與測算得到的分子質量1 809相符，純度達到95%以上，兩種標記多肽的純度均符合后續實驗要求。

Fig.2 LC-MS spectrum of RKDVY-FITC(A)and NapGDFDFDYGRKDVY-FITC(B)圖2RKDVY-FITC（A）及NapGDFDFDYGRKDVY-FITC（B）的LC-MS譜圖

2.3 胸腺五肽超分子水凝膠的制備及表征 成膠測試結果表明，多肽分子NapGDFDFDYGRKDVY加熱冷卻后5 min內即可形成透明的水凝膠，其最低成膠濃度為1 g/L（圖3A）；透射電鏡結果表明，形成的水凝膠內部由密集交錯的直徑約為20～30 nm的長纖維構成（圖3B）；流變測試結果表明，在0.1～100 rad/s的測試頻率范圍內，該水凝膠的彈性模量G′始終大于其黏性模量G′′，表明該水凝膠具有良好的延展性（圖3C）。

Fig.3 The optical image(A),TEM image(B)and rheology property(C)of NapGDFDFDYGRKDVY supramolecular hydrogel圖3 NapGDFDFDYGRKDVY超分子水凝膠的光學照片（A）、透射電鏡照片（B）以及流變學表征（C）

2.4 細胞攝取實驗 小鼠RAW 264.7巨噬細胞對RKDVY-FITC及NapGDFDFDYGRKDVY-FITC的攝取結果，見圖4。孵育4 h后，RKDVY-FITC作用后的細胞內能觀察到較弱的FITC熒光信號，表明游離狀態的RKDVY-FITC通過被動擴散進入細胞并在細胞內少量滯留；而NapGDFDFDYGRKDVY-FITC作用后的細胞內FITC熒光信號則明顯強于RKDVYFITC，表明細胞對NapGDFDFDYGRKDVY有較強的攝取性能。

2.5 體外免疫調節實驗 空白對照組、RKDVY組及NapGDFDFDYGRKDVY組作用后的細胞上清中TNF-α的濃度呈依次增加趨勢（F=644.1，P＜0.05），見圖5。

Fig.4 Cellular uptake of free thymopentin and thymopentin-containing nanofibers in RAW 264.7 cells after 4-hour incubation圖4 RAW 264.7細胞對游離胸腺五肽及胸腺五肽納米纖維在4 h后的攝取結果

Fig.5 The amount of TNF-α in RAW 264.7 cells stimulated by free thymopentin and thymopentin-containing nanofibers for 24 hours圖5 RAW 264.7細胞在游離胸腺五肽及胸腺五肽納米纖維刺激24 h后分泌TNF-α的含量

3 討論

基于多肽自組裝的超分子水凝膠由于具有容易設計合成、生產成本低以及生物相容性好等優勢，近年來在藥物遞送、免疫佐劑、腫瘤治療等方面表現出了較大的應用潛能［7-8］。Zhao等［9］發現包括活性肽在內的藥物小分子經共價修飾到特定的短肽上后，可自組裝形成納米纖維、納米粒子等自傳輸的藥物遞送系統，從而能夠實現提高藥物穩定性和活性的目的。另外，Wang等［10-11］研究表明，疏水性五肽-NapGFFY/NapGDFDFDY具有較強的自組裝凝膠化性能，其本身并無免疫調節作用，但能夠作為抗原載體提高機體對特定抗原的免疫應答。本研究設計合成的自組裝活性肽在分子結構上主要由疏水性的NapGDFDFDY和親水性的RKDVY構成，得到的衍生多肽-NapGDFDFDYGRKDVY能夠經加熱-冷卻形成穩定的水凝膠。其成膠原理為：化合物分子在加熱高溫下溶解，溫度降低后溶解度逐漸降低，當溶解與析出達到平衡時，分子發生自組裝形成網狀納米纖維將水分子包裹住，從而形成肉眼可見的水凝膠。由于多肽中天然存在的L構型氨基酸容易被活性蛋白酶快速降解［12］，因此本研究用D構型的FFY取代L構型的FFY，得到的自組裝多肽有望在一定程度上提高RKDVY的穩定性和生物利用度。

RKDVY作為一種親水性短肽，具有極高的水溶性，其溶解度可達10 g/L以上。由于構成細胞膜主要成分的磷脂雙分子層在結構上是兩親性的，致使太親水及太疏水的活性小分子都不易穿過細胞膜屏障進入細胞，存在細胞膜滲透性差的缺陷。Cai等［13］發現相較于游離小分子通過被動擴散的方式進入細胞，形成納米結構后的藥物分子則可以通過能量依賴的主動運輸途徑進入細胞，從而極大提高細胞攝取率。本研究中，相較于游離RKDVY，RAW 264.7細胞對NapGDFDFDYGRKDVY的攝取量顯著增強，與上述文獻結論相一致，表明納米結構的形成可以有效提高RKDVY的細胞攝取結果。

作為免疫調節功能的一部分，RKDVY已經被證實能夠刺激未分化的巨噬細胞產生TNF-α，良好的細胞攝取滯留性能是其在細胞內發揮其功能作用的基本保障。RKDVY由于極短的半衰期（30 s），在臨床應用中需要不斷重復注射以維持其活性，從而給患者增加了額外的痛苦和負擔［5］。目前，已有報道采用納米制劑物理包裹的方式來提高RKDVY的半衰期和治療療效。如Yin等［14］利用修飾有凝集素的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）納米粒子包載RKDVY以提高其口服給藥的效果。Zhang等［6］制備了生物可吸收的聚乳酸-聚 乙 二 醇 -聚 乳 酸［polylactide-poly（ethylene glycol）-polylactide，PLA-PEG-PLA］水凝膠，通過物理包裹的方式實現了對RKDVY的可控釋放。相比于物理包裹方法，本研究通過共價修飾制備得到的胸腺五肽自傳輸水凝膠，具有合成簡單、可重復性好、載藥量高等優勢。本研究體外細胞免疫調節實驗結果表明，相較于游離RKDVY，NapGDFDFDYGRKDVY具有更強的免疫調節性能，為下一步體內研究提供了基礎。另外，有研究表明納米纖維經物理打散后可通過靜脈注射的方式進入體內血液循環，進一步通過增強的通透性和滯留性效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）富集到腫瘤等病灶部位［15］，因此，本研究制備的納米纖維有望極大提高RKDVY的體內免疫調節效果。本研究為RKDVY結構修飾及治療活性的提高提供了新的方法與思路。

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