VEGF對體外培養絨山羊次級毛囊外根鞘細胞的影響

張婧婧，王德光，周小兵，高 曄，何曉琳，陳玉林，張恩平(西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

毛囊是哺乳動物皮膚中普遍存在的衍生器官[1]，由毛球、連接組織鞘、外根鞘、內根鞘和毛干等部分構成，并始終發生著周期性的變化：生長期、退行期和休止期[2]。毛囊中大約包含20多種細胞，這些細胞在體內通過復雜的相互作用，共同參與毛囊生長、發育、分化與周期性調節[3]。外根鞘(outer root sheat, ORS)由厚的細胞層組成，包裹在內根鞘和毛干的外側，成為毛囊與真皮層的分界線[4]。外根鞘細胞(outer root sheath cells, ORSCs)是成熟毛囊在分化過程中幸存下來的，形態學上類似于上皮的角質化細胞[5]，在毛囊周期、毛發生長和創傷愈合期間起重要的作用[6]。生長期階段，外根鞘細胞可以產生終止生長期的信號并使得毛囊進入退行期[5]；皮膚損傷時，外根鞘細胞會分化形成上皮細胞[7]。

血管內皮生長因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)是一類多功能的細胞因子，可促進內皮細胞增殖、促進血管生成以及增加血管的通透性[8]，并在創傷愈合、胚胎發育、視網膜血管新生風濕性關節以及腫瘤的生長和轉移中都起重要的作用[9]。近些年研究發現，VEGF在毛囊中表達并作用于毛囊。Yano等[10]以轉基因小鼠為試驗模型，過表達毛囊外根鞘中的VEGF，發現相同時間內VEGF轉基因小鼠比野生型小鼠的毛發生長快，同時通過石蠟切片組織學觀察發現VEGF轉基因小鼠的毛囊更密更大。Wu等[11]利用MTT法檢測外根鞘細胞的增殖，發現在培養液中添加VEGF可以促進人毛囊外根鞘細胞的增殖。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因是鑒定體外培養細胞增殖的一個基因，是細胞增殖的特異性標記；角蛋白10(keratin 10，K10)是細胞分化的特異性標記。PCNA和K10均在外根鞘細胞中特異性表達。成纖維細胞生長因子5(fibroblast growth factor 5，FGF5)與哺乳動物毛發生長密切相關。本試驗以體外培養的絨山羊次級毛囊外根鞘細胞為對象，研究培養液中添加VEGF對次級毛囊外根鞘細胞的增殖、分化及PCNA、K10和FGF5基因表達量的影響，為進一步研究絨山羊次級毛囊發育機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

選取臨床健康的雌性成年陜北白絨山羊(陜西省陜北白絨山羊原種場，榆林市橫山縣)，采取體側部約0.5 cm×2.0 cm的皮膚樣品，置于無菌PBS中，4 ℃條件下帶回實驗室。

1.2 主要試劑及其配制

EpiLife Medium with 60 μmol·L-1calcium, HKGS, Coating Matrix, 胎牛血清, 0.25%胰蛋白酶(g·dL-1), 1×PBS粉末(Gibco, 美國)；DispaseII(Roche, 瑞士)；雙抗(青霉素、鏈霉素, HyClone，美國)；DMSO、VEGF、MTT粉末(Sigma, 美國)；Cell-LightTMEdU Apollo?488invitroImaging Kit(100T)(RiboBio，廣州)；純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit北京康為世紀公司)；反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)及熒光定量試劑盒(TaKaRa，日本)。

0.25%中性蛋白酶消化液(dispase II)：使用前，0.25 g DispaseII粉末溶于100 mL無血清DMEM/F12培養液中，充分溶解混勻后，過濾除菌。

PBS：1×PBS粉末溶解于1 L的去離子水中，加入1 mL雙抗(100 IU)，過濾除菌，分裝保存。

MTT液：稱取0.5 g MTT粉末，充分溶解于100 mL PBS中，過濾除菌，-20 ℃保存。

細胞培養液： EpiLifeTM培養基 90 mL添加HKGS(包含0.2%BPE(v/v)，5 μg·mL-1牛胰島素，0.18 μg·mL-1氫化可的松，5 μg·mL-1牛轉鐵蛋白, 0.2 ng·mL-1人表皮生長因子) 0.9 mL、胎牛血清9 mL，雙抗(100 IU·mL-1)0.1 mL，總體積為100 mL。

1.3 樣品處理

將置于無菌PBS中的皮膚樣品帶入細胞操作間，用75%的酒精浸泡進行樣品表面滅菌，無菌PBS液沖洗4～5次，在體視鏡下將樣品切成寬度為0.2 cm左右的皮膚組織片、浸泡在無菌0.25% dispaseII中，4 ℃消化4.5 h，在PBS液中清洗2～3次。消化結束的樣品在體視鏡下，用眼科鑷子順毛囊方向將毛囊剝離出來，此時的毛囊無真皮鞘。

1.4 原代培養和傳代培養與純化

將剝離的毛囊分離初級和次級毛囊,分別放入2 mL離心管中，加入300～400 μL的0.25%胰蛋白酶溶液消化20～25 min，消化過程中可在顯微鏡下觀察消化情況；消化結束時，加入含有血清的培養液終止消化，吹打10～15次；去除多余的毛囊，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入新的培養液1 mL重懸細胞，移入預先鋪有Coating Matrix的培養皿中，再加入1 mL培養液，在培養箱中靜置培養4～5 d，發現有貼壁細胞后，更換培養液，之后每2～3 d更換1次培養液。

當原代細胞生長匯合時，進行傳代。首先棄舊培養液，PBS清洗兩次，加入適量0.25%胰蛋白酶，處理細胞數十秒，棄胰酶液體，然后加入1 mL新的0.25%胰蛋白酶(g·dL-1)消化3～4 min，含血清培養液終止消化，并吹打成細胞懸液，移入2 mL離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，收集細胞，加入新的培養皿中，每2～3 d更換1次培養液。前3代細胞傳代時，新的培養皿中都需要預先鋪好涂層培養基(coating matrix)。

在原代細胞和初次傳代細胞貼壁后，采用細胞時間差酶消化法純化。

1.5 細胞生長曲線的測定

收集第5代處于對數生長期次級毛囊外根鞘細胞，制成細胞懸液。計數調整細胞密度為0.5×104·mL-1，將細胞懸液接種于24孔細胞培養板中，每孔1 mL。每隔24 h,取3個孔的細胞分別進行計數，取平均值。以培養時間為橫坐標，每隔24 h的細胞數平均值為縱坐標作圖，即得次級毛囊外根鞘細胞的生長曲線。

1.6 毛囊外根鞘細胞的免疫細胞化學鑒定

對絨山羊毛囊外根鞘細胞采用鏡下觀察和選用CK17、CK15進行免疫熒光染色鑒定。免疫熒光染色步驟參考文獻[12]，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

建筑施工行業是一個勞動密集型的產業，機械化水平較低，施工過程中需要依靠大量的工人參與手工作業，無法像工廠一樣大規模生產出標準化的產品，不可避免地會產生一些缺陷或偏差。

1.7 次級毛囊外根鞘細胞的活性檢測

選擇第5代次級毛囊外根鞘細胞，使96孔板中每孔的細胞密度為3×104·mL-1，待細胞長至70%～80%,加入不同質量濃度VEGF(0、1、10、50和100 ng·mL-1)的培養液，其中0 ng·mL-1為對照組，每個濃度分別處理24和48 h后，每孔加入20 μL的MTT (5 mg·mL-1)，于28 ℃、5%CO2條件下，繼續培養4 h，吸棄培養液，用PBS洗1次，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，28 ℃孵育10 min，溶解細胞中的甲臢。使用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度值，每組6個重復。

1.8 次級毛囊外根鞘細胞的增殖檢測

選擇第5代次級毛囊外根鞘細胞，使96孔板中每孔的細胞密度為3×104·mL-1，待細胞長至70%～80%后，加入不同質量濃度VEGF(0、1、10、50和100 ng·mL-1)的培養液，其中0 ng·mL-1為對照組，每個濃度處理48 h后，每孔加入100 μL的EdU培養液，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續培養2 h后，進行Apollo染色和Hoechst33342染色。使用熒光顯微鏡觀察并記錄，每個孔隨機選擇5個視野拍照。

1.9 次級毛囊外根鞘細胞中與增殖和分化相關基因mRNA表達的檢測

選擇第5代次級毛囊外根鞘細胞，使96孔板中每孔的細胞密度為3×105·mL-1，待細胞長至70%～80%后，加入不同質量濃度VEGF(0、10、100 ng·mL-1)，其中0 ng·mL-1為對照組，每個濃度分別處理24和48 h，根據試劑盒說明書提取RNA，反轉錄成cDNA，-80 ℃保存。

以NCBI上山羊β-actin作為內標基因，同時參照山羊PCNA、K10、FGF5 mRNA的 CDS區序列，使用Primier 5.0軟件設計跨內含子的特異性引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1實時熒光定量PCR引物序列

Table1PrimersequencesforReal-timequantitativePCR

基因Gene基因登錄號GenBankID引物序列(5′→3′)Primersequence產物長度/bpProductlengthβ?actinXM＿005694067．1S：TGCGTGACATCAAGGAGAAGC198A：GGATGCCACAGGACTCCATACCCPCNAXM＿005688167S：CAGGCGTTCGTAATCGTG298A：TCGCAGCGGTAAGTGTCGK10XM＿013972064S：GTTCGATACAGCTCAAGCAAGCAA159A：AGCAGAGCTCCCACGGCTAAFGF5EF042192．1S：CAGAGTGGGCATCGGTTTC121A：TATTCCTACAATCCCCTGAGACA

S.上游引物；A.下游引物

S. Sense primer；A. Antisense primer

采用TaKaRa公司的熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，以β-actin為內標基因，利用Bio-Rad iQ5實時定量PCR儀對各待測cDNA樣品中PCNA、K10、FGF5 mRNA的表達量進行測定，每個樣品3次重復。q-PCR反應體系及反應條件參考文獻[13]。

1.10 數據分析

所有樣品用β-actin進行歸一化處理，同時以內標基因β-actin作為參照基因，用2-△△Ct法計算PCNA、K10、FGF5 mRNA的相對表達量。所有數據均以“平均值±標準誤(mean±SE)”表示。采用SPSS18.0統計軟件進行獨立樣本t檢驗(one samplettest)，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結 果

2.1 陜北白絨山羊毛囊外根鞘細胞體外培養

A.初級毛囊；B.次級毛囊；C.培養6 d的初級毛囊外根鞘細胞；D.培養6 d的次級毛囊外根鞘細胞；E.培養12 d的初級毛囊外根鞘細胞；F.培養12 d的次級毛囊外根鞘細胞A. Primary hair follicle；B. Secondary hair follicle；C. Primary hair follicle ORSCs cultured 6 d；D. Secondary hair follicle ORSCs cultured 6 d；E. Primary hair follicle ORSCs cultured 12 d； F. Secondary hair follicle ORSCs cultured 12 d

圖1 毛囊外根鞘細胞體外培養(40×)Fig.1 The hair follicle outer root sheath cells in vitro cultured (40×)

2.2 絨山羊毛囊外根鞘細胞的鑒定

CK17是外根鞘細胞的特異性標記[20]，如圖2所示，CK17的細胞免疫組化結果呈陽性，表明培養細胞為次級毛囊外根鞘細胞。CK15是毛囊干細胞的特異性標記[22]，圖3顯示，CK15的細胞免疫組化結果呈陽性，表明外根鞘細胞中有毛囊干細胞。

2.3 次級毛囊外根鞘細胞生長曲線

次級毛囊外根鞘細胞生長曲線見圖4。由圖4可知，體外培養1 d左右，細胞貼壁并開始緩慢增殖；培養2～3 d，細胞增殖速度緩慢增加；3～5 d，細胞進入快速增殖期，呈現對數生長；培養5 d后，細胞進入平穩期并很快進入衰退期。細胞生長曲線呈典型的“S”型。

2.4 MTT法檢測次級毛囊外根鞘細胞的增殖

MTT法檢測次級毛囊外根鞘細胞的增殖結果見圖5。如圖5所示，VEGF濃度和處理時間對次級毛囊外根鞘細胞增殖均有影響。相同處理時間(處理24或48 h)，50 ng·mL-1組和100 ng·mL-1組的細胞活力均顯著或極顯著高于對照組、1 ng·mL-1組和10 ng·mL-1組(P<0.05和P<0.01)；VEGF處理48 h時，100 ng·mL-1組的細胞活力顯著高于50 ng·mL-1組(P<0.05)。相同濃度VEGF，處理48 h的細胞活力均極顯著高于處理24 h(P<0.01)。

A.CK17；B.DAPI；C.Overlay

圖2 細胞免疫熒光鑒定(CK17) (200×)Fig.2 Cytoimmunochemistry of CK17 (200×)

A.CK15；B.DAPI；C.Overlay

圖3 細胞免疫熒光鑒定(CK15) (200×)Fig.3 Cytoimmunochemistry of CK15 (200×)

2.5 EdU檢測次級毛囊外根鞘細胞的增殖

EdU檢測次級毛囊外根鞘細胞的增殖結果見圖6和圖7。圖6為VEGF處理48 h后1個視野中EdU標記的次級毛囊外根鞘增殖細胞染色照片，圖7為染色增殖細胞計數結果。如圖7所示，VEGF處理48 h，100 ng·mL-1組和50 ng·mL-1組的細胞計數極顯著高于對照組、1 ng·mL-1組、10 ng·mL-1組(P<0.01)，100 ng·mL-1組的細胞計數顯著高于50 ng·mL-1組(P<0.05)。

圖4 次級毛囊外根鞘細胞生長曲線Fig.4 Secondary hair follicle ORSCs growth curve

*與**.同色柱或連線色柱之間比較差異顯著或極顯著(P<0.05或 P<0.01)。下同* and **means significant difference(P<0.05 and P<0.01)between columns with same color or with connecting line respectively. The same as follows

圖5 VEGF處理的細胞活力檢測Fig.5 Detection of cell activity treated with VEGF

圖6 VEGF處理48 h EdU標記的增殖細胞染色照片 (200×)Fig.6 EdU mark the staining pattern of proliferation cells treated with VEGF for 48 h (200×)

圖7 EdU標記增殖細胞計數(48 h)Fig.7 Counting of EdU mark proliferating cells (48 h)

2.6 PCNA、K10和FGF 5基因mRNA在次級毛囊外根鞘細胞中的表達

PCNA、K10和FGF5基因mRNA在次級毛囊外根鞘細胞中的表達情況見圖8。圖8A顯示，PCNAmRNA在次級毛囊外根鞘細胞中有表達，表達量隨VEGF濃度的增加而增加。相同處理時間(處理24或48 h)，PCNAmRNA表達量均以100 ng·mL-1組的最高，極顯著高于對照組(P<0.01)，顯著高于10 ng·mL-1組(P<0.05)。VEGF處理24 h，10 ng·mL-1組PCNAmRNA的表達量顯著高于對照組(P<0.05)。由圖8B可知，角蛋白K10 mRNA在次級毛囊外根鞘細胞中有表達，VEGF處理可降低其表達量。VEGF處理24 h， 100 ng·mL-1組K10 mRNA 的表達量顯著低于對照組(P<0.05)；處理48 h，10 ng·mL-1組和100 ng·mL-1K10 mRNA的表達量極顯著低于對照組(P<0.01)。VEGF處理時間對K10 mRNA的表達量也有影響，100 ng·mL-1組處理48 h的表達量顯著低于處理24 h的表達量(P<0.05)。

FGF5基因在次級毛囊外根鞘細胞中的表達情況見圖8C。由圖8C可知，FGF5 mRNA在次級毛囊外根鞘細胞中有表達，VEGF處理可抑制其表達，隨著VEGF濃度增大，FGF5 mRNA表達量呈下降趨勢。VEGF處理48 h，100 ng·mL-1組FGF5 mRNA的表達量極顯著低于對照組(P<0.01)。

圖8 PCNA、K10和 FGF 5 mRNA在次級毛囊外根鞘細胞中的表達Fig.8 Expression of PCNA, K10 and FGF 5 mRNA in secondary hair follicle ORSCs

3 討 論

3.1 絨山羊次級毛囊外根鞘細胞的體外培養和鑒定

絨山羊具有異質的雙重被毛，由無髓的絨毛和髓質發達的粗毛組成。山羊絨是毛被下層無髓毛，由次級毛囊生成[14]。初級毛囊不隨季節發生周期變化，與初級毛囊相比較，次級毛囊呈現出周期性的季節變化[15]。外根鞘是次級毛囊的主要組成部分，外根鞘細胞可以產生終止生長期的信號并使得毛囊進入退行期[5]，對次級毛囊的周期發育起到重要的作用。因此，本研究選擇培養絨山羊次級毛囊外根鞘細胞。

外根鞘細胞的培養方法多采用組織法和消化法。二者相比較，組織法的細胞增殖快不易傳代；消化法的細胞可以傳8～10代[16]。本試驗采用消化培養法，選擇處于生長期的毛囊，此時的外根鞘最厚。崔正軍等[17]通過對比DispaseⅡ和胰酶消化法對大鼠皮膚角朊細胞分離的研究發現，在相同消化時間下，DispaseⅡ消化法可以分離皮膚的表皮和真皮結合處，并獲得活力較高的角朊細胞，因此本試驗中也采用DispaseⅡ消化皮膚樣品。由于試驗中需要剝離出帶有外根鞘的毛囊，因此在DispaseⅡ的消化時間不需要太長，經優化后皮膚樣品剪成厚度0.2 cm左右的長條，DispaseⅡ的消化時間為4.5 h左右；外根鞘細胞屬于上皮樣細胞，在原代培養時較難貼壁。Aasen等[18]通過在培養皿中鋪入Coating Matrix成功培養出了皮膚中的角質細胞，且細胞活性很高，因此本研究中也選擇在培養皿中鋪一層Coating Matrix，以促進次級毛囊外根鞘細胞很好的貼壁生長。Cui等[19]用無血清培養液(K-SFM)培養外根鞘細胞，且細胞能夠穩定健康的生長，而本研究中發現用無血清培養液培養(epilife medium)的細胞雖然可以傳代，但細胞形態上會變為梭形且逐漸凋亡，所以選擇在培養液中添加血清，存在這樣差異的原因可能是所用無血清培養液的成分不同。外根鞘細胞是一種未分化的角質化細胞[18]，細胞內表達多種角蛋白，所以在外根鞘細胞的表面存在許多特異性標記，Vidal等[20]發現角蛋白17在外根鞘中特異表達，認為是外根鞘細胞的特異性標記，可用CK17鑒定外根鞘細胞。毛囊外根鞘隆突部是毛囊干細胞的重要儲存點[21]，角蛋白K15是隆突部毛囊干細胞的特異性標記，在人和小鼠的毛囊隆突部均有高表達[22]，經CK15鑒定，發現培養的絨山羊外根鞘細胞中包含有毛囊干細胞。就目前的技術條件而言，分離培養外根鞘細胞的方法存在雜有毛囊干細胞的缺陷，進一步分離可以采用流式細胞儀分離及純化外根鞘細胞。

3.2 VEGF對次級毛囊外根鞘細胞增殖、分化的影響

次級毛囊外根鞘在毛囊周期中的變化：生長期，外根鞘細胞向下遷移與毛乳頭結合開啟毛囊重建，新的外根鞘出現并增殖變厚；退行期，外根鞘開始凋亡并持續變薄；靜止期，外根鞘最薄且形態持續不變[23]。從外根鞘在毛囊周期中的變化可以看出，外根鞘細胞在生長期持續增殖，促進外根鞘細胞增殖的因子有IGF-I、HGF、VEGF和TGF-β1[24]。Li等[25]利用q-PCR、WB和免疫組化法研究發現，VEGFR-2受體在人外根鞘細胞中表達；在人外根鞘細胞體外培養液中添加不同濃度VEGF發現，高濃度VEGF可以促進人外根鞘細胞增殖。VEGF對絨山羊次級毛囊外根鞘細胞增殖同樣有促進作用。MTT的檢測結果顯示， VEGF濃度為100 ng·mL-1，處理48 h時，對次級毛囊外根鞘細胞的促進效果極顯著高于對照組(P<0.01)。EdU標記檢測顯示了同樣結果：處理48 h時，VEGF濃度為100 ng·mL-1時對細胞增殖的促進效果極顯著高于對照組(P<0.01)。PCNA是鑒定體外培養細胞增殖的一個基因，是細胞增殖的特異性標記，且在外根鞘細胞中特異性表達[26]。q-PCR顯示PCNAmRNA在VEGF濃度為100 ng·mL-1時表達量最高且極顯著高于對照組(P<0.01)，說明VEGF對絨山羊次級毛囊外根鞘細胞的增殖具有促進作用。外根鞘細胞是未分化的角質化細胞，當皮膚受損時，外根鞘細胞會向上遷移并分化為上皮細胞[7]。因此，外根鞘是如何分化及影響其分化的分子機制需要深入研究。角蛋白K10是細胞分化的特異性標記，在外根鞘細胞中特異性表達[26]。q-PCR顯示，VEGF處理48 h時，K10 mRNA在VEGF濃度為10和100 ng·mL-1時表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，說明VEGF對絨山羊次級毛囊外根鞘細胞的分化具有抑制作用，目前國內有關VEGF影響外根鞘細胞分化分子機理的研究鮮有報道，有待深入研究。

3.3 VEGF對次級毛囊外根鞘細胞中FGF 5基因mRNA表達的影響

國內外研究發現，FGF5基因自發突變與人[27]、小鼠[28]、貓[29]、狗[30]等哺乳動物呈現較長毛發的表型相關。Hébert等[31]通過轉基因技術構建FGF5基因敲除小鼠，該小鼠也出現類似毛發增長的表型，通過免疫組化及mRNA原位雜交的技術對FGF5 mRNA及蛋白表達進行定位，發現FGF5表達于外根鞘細胞。Yano等[10]通過原位雜交技術發現VEGFmRNA高表達于毛囊生長期中期的外根鞘中；以轉基因小鼠為試驗模型，過表達毛囊外根鞘中的VEGF，發現相同時間內VEGF轉基因小鼠比野生型小鼠的毛發生長快；敲除VEGF基因后發現抑制了毛發的生長。說明VEGF通過作用于毛囊外根鞘促進小鼠毛發的生長。本研究結果顯示，隨著VEGF濃度的升高，體外培養的毛囊外根鞘細胞中，FGF5 mRNA的表達量呈下降趨勢；處理48 h，VEGF濃度為100 ng·mL-1時，次級毛囊外根鞘細胞中FGF5 mRNA的表達量極顯著低于對照組(P<0.01)，說明VEGF可以抑制FGF5的表達。FGF5基因參與誘導次級毛囊退行期的發生，Housley等[30]通過體外培養人毛囊發現，在培養基中添加FGF5重組蛋白，可誘導毛囊退行期的提前發生。因此，推測VEGF可以通過抑制FGF5的表達促進毛囊生長，而VEGF是如何通過抑制FGF5來促進毛囊生長的相關分子機制需要進一步的研究證實。

4 結 論

本研究成功分離并培養出陜北白絨山羊次級毛囊外根鞘細胞；VEGF能夠促進次級毛囊外根鞘細胞增殖，抑制外根鞘細胞分化；VEGF抑制外根鞘細胞中FGF5基因的表達。

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