環境高溫誘導巴馬香豬睪丸細胞凋亡并激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路

李延森，李照見，賈瀟瀟，李春梅(南京農業大學動物科技學院，南京 210095)

夏季環境高溫引起的公豬熱應激是困擾公豬生產的一大難題。隨著全球氣候變暖趨勢加劇，近年來許多地區，特別是長江中下游地區相繼出現夏季持續性高溫高熱天氣，一些城市(武漢、南京、蘇州、上海、杭州)夏季高溫更是突破40 ℃，致使畜舍飼養環境溫度大幅升高。夏季高溫會引起公豬生理內分泌紊亂和公豬睪丸機能障礙，精液品質下降[1]，間接導致母豬受胎率降低和胎兒不良發育[2]，進而降低生豬生產能力，給畜牧業造成巨大經濟損失。研究發現，高溫引起的睪丸組織氧化應激以及生精上皮細胞凋亡和死亡，直接導致生精上皮損傷，精子活力和密度的降低[3-4]。核轉錄因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)信號通路能夠顯著誘導機體內源性抗氧化應答，其缺失或激活障礙，會加劇氧化應激程度，使細胞內正常氧化還原穩態失衡，導致細胞功能障礙，引起細胞毒性，細胞凋亡或死亡，它是目前發現的細胞抗氧化應答的核心途徑之一[5-6]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)能被各種引起細胞氧化應激損傷的因素所誘導，其mRNA和蛋白質在組織中的表達上調通常也被認為是氧化應激的標志，HO-1及其催化產物作為體內具有高活性的抗氧化成分，能高效清除細胞過量的活性氧，緩解細胞應激，維持細胞氧化還原平衡，發揮細胞保護作用[7]。已有研究表明，Nrf2蛋白和HO-1蛋白可以在睪丸間質細胞高水平表達，可有效緩解應激原引起的睪丸組織細胞損傷和精子生成障礙[8-10]。然而，目前與睪丸組織細胞Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達相關研究只局限在人或鼠上，還未發現豬睪丸組織細胞中表達定位Nrf2蛋白和HO-1蛋白的報道，也沒有發現測定豬睪丸組織細胞Nrf2蛋白通路或HO-1蛋白表達模式的研究報道。因此，本試驗旨在通過研究高溫環境對巴馬香豬陰囊溫度分布和睪丸組織中抗氧化和細胞凋亡相關蛋白表達的影響，揭示豬陰囊散熱機制，明確豬睪丸組織細胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達定位模式，為探索從細胞抗氧化分子機制方面緩解高溫環境導致的公豬精液品質下降提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選取巴馬香豬(泰州泰和生物科技有限公司)為試驗對象。

1.2 試驗設計

選取7月齡體重相近雄性巴馬香豬(平均體重(17.93±0.91) kg)12頭，隨機分成2組，對照組和高溫組，每組6頭。對照組飼養環境溫度保持在25 ℃，高溫組飼養環境溫度為24 h從25～40 ℃循環變溫(變溫分4個階段：①09:00-10:00, 25 ℃→40 ℃；②10:00-15:00, 40 ℃；③ 15:00-16:00, 40 ℃→26 ℃；④16:00-09:00, 25 ℃)，連續8 d。高溫期間使用熱成像儀(TiR27，Fluke Corporation，Washington，USA)記錄動物體表溫度和陰囊皮膚溫度分布。測量陰囊皮膚溫度數值是指單次測量時整個陰囊皮膚溫度的平均值。體表溫度數值是指單次測量時整個體表溫度，包括動物頭、耳朵、軀體、四肢和尾巴表面溫度的平均值。測量的溫度數值通過Fluke Smart View 3.1 圖像分析軟件分析所得。

1.3 樣品采集與處理

第8天高溫處理結束后，取豬睪丸器官，浸于4%多聚甲醛溶液，用于免疫組織化學檢測抗氧化通路標志蛋白Nrf2，抗氧化蛋白HO-1和細胞凋亡標志蛋白(cleaved caspase 3，c-caspase 3)的組織表達情況。

1.4 組織切片和免疫組織化學檢測

4%多聚甲醛溶液固定好的睪丸組織，依次分別通過梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋和切片，制作睪丸組織石蠟切片；然后，依次通過二甲苯和梯度酒精脫蠟止水后，用3% H2O2-甲醇處理1 h,消除內源性過氧化物酶活性；再用0.01 mol·L-1檸檬酸三鈉(pH=6.0)微波爐抗原熱修復10 min，冷卻，0.01 mol·L-1PBS(pH=7.2～7.4)洗滌3次；10%上樣血清封閉1 h，甩干，分別加一抗Nrf2抗體(abcam, ab53019)，HO-1抗體(abcam, ab13248)，c-caspase 3(cell signaling, 9661S)抗體過夜；甩去一抗，PBS搖床洗3次，甩干，加二抗，濕盒孵育2 h，PBS搖床洗3次，甩干，加SARC濕盒孵育1 h，PBS搖床洗3次，DAB顯色，鏡檢蛋白著色表達情況；蘇木素復染40 s，沖洗返藍，常規脫水，透明，封片，最后鏡檢拍照。光鏡下觀察,棕色顆粒染色表示蛋白呈陽性。利用Image Pro Plus 6.0 軟件(media cybernetics bethesda, MD, USA)分析對照組和高溫組睪丸組織Nrf2和HO-1蛋白表達情況。對細胞核陽性表達c-caspase 3的細胞進行計數，分別獲得細胞核陽性表達c-caspase3細胞的百分比。

1.5 數據分析

采用GraphPad Prism Version 5.0 統計軟件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)進行數據分析，所有數據用“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示，對照組和高溫組睪丸組織蛋白表達采用t檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 環境高溫對巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度分布的影響

由表1可知，高溫組豬體表溫度顯著升高，升高幅度達到1.9 ℃，所測體表溫度范圍中最大溫度點為39.7 ℃，最小溫度點為34.9 ℃，對照組最大溫度點為38.8℃，最小溫度點為28.0 ℃；高溫組豬陰囊表面平均溫度顯著升高，升高幅度達到3.7 ℃，所測陰囊表面溫度范圍中最大溫度點為38.4 ℃，最小溫度點為36.3 ℃，對照組分別為最大溫度點為35.0 ℃，最小溫度點為31.7 ℃，最大溫度和最小溫度分別升高3.4 ℃和4.6 ℃。高溫組陰囊皮膚升高溫度幅度大于體表溫度升高幅度。與對照組相比，高溫組豬活動減少，表現嗜睡。由圖1可知，豬體體表溫度升高幅度較高部分為豬頭、耳朵、四肢以及背部，相比之下腹部溫度升高幅度較低。發射率表示物體表面輻射出的能量與相同溫度的黑體輻射能量的比率。

表1環境高溫對巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度參數的影響

Table1EffectofhighambienttemperatureonbodyandscrotalsurfacetemperaturesinBamaminiaturepig

部位Position分組Treatment平均溫度/℃Avergetemperature最小溫度/℃Minimumtemperature最大溫度/℃Maximumtemperature發射率Emissivity體表Bodysurface對照Thermalneutral36．6±1．14a28．038．80．95高溫Heat?treated38．5±0．59b34．939．70．95陰囊表面Scrotalsurface對照Thermalneutral33．4±0．71?31．735．00．95高溫Heat?treated37．1±0．37?36．338．40．95

同列數據上標小寫字母不同表示體表溫度組間差異顯著(P<0.05)，*.陰囊表面溫度組間差異顯著(P<0.05)(n=6)

Differentsmall letters in the same colum means significant difference in the body surface between the thermal neutral and the heat-treated treatments(P<0.05)，* in the same colum means significant difference in the scrotal surface between the thermal neutral and the heat-treated treatments(P<0.05)(n=6)

A.對照組豬熱紅外分布圖；B.對照組豬可見光圖；C. 高溫組豬熱紅外分布圖；D. 高溫組豬可見光圖。T.睪丸A.The infrared images of pigs in the thermal neutral group；B.The infrared images of pigs in the thermal neutral group；C.The visible images of pigs in the heat-treated group；D.The visible images of pigs in the heat-treated group.T.Testis

圖1 環境高溫條件下巴馬香豬體表和陰囊皮膚熱紅外分布圖Fig.1 The infrared distribution images of body and scrotal surface in Bama miniature pig under high ambient temperature

2.2 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達的影響

由圖2可知，Nrf2蛋白主要在睪丸間質細胞表達(圖2A1，B1,C,D)，在睪丸生精小管表達較低(圖2A2，B2)。高溫環境影響巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達，主要對睪丸間質細胞中Nrf2蛋白表達產生顯著影響，與對照組相比，高溫組睪丸間質細胞Nrf2蛋白表達顯著升高(圖2E，P<0.05)。對照組睪丸間質細胞核顯示為藍色，而高溫組睪丸間質細胞核顯示為明顯的棕色(圖2 B1)，這說明細胞核Nrf2蛋白表達明顯升高。高溫環境影響巴馬香豬睪丸生精小管上皮組織Nrf2蛋白表達，與對照組相比，高溫組睪丸生精上皮組織Nrf2蛋白表達顯著升高(圖2E，P<0.05)

2.3 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達的影響

由圖3可知，HO-1蛋白主要在睪丸間質細胞表達(圖3 A1，B1，C,D)，在睪丸生精小管表達較低(圖3 A2，B2)，與Nrf2表達模式相似，不同的是HO-1蛋白在高溫組和對照組睪丸間質細胞核的表達相似，高溫組并沒有出現明顯的細胞核HO-1蛋白棕色染色現象，這證明了Nrf2的核轉錄因子作用。高溫環境影響巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達，主要對睪丸間質細胞中HO-1蛋白表達產生顯著影響，與對照組相比，高溫組睪丸間質細胞HO-1蛋白表達顯著升高(圖3E，P<0.05)，對照組睪丸間質細胞核與高溫組睪丸間質細胞核都表現藍色(圖3 B1)，說明高溫不改變細胞核HO-1蛋白表達，或者高溫不促進HO-1蛋白在細胞核中累積。高溫環境影響巴馬香豬睪丸生精小管上皮組織HO-1蛋白表達，與對照組相比，高溫組睪丸生精上皮組織HO-1蛋白表達顯著升高(圖3E，P<0.05)。

2.4 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白細胞百分比的影響

由圖4可知，正常情況下，睪丸間質和睪丸生精上皮細胞核都會陽性表達c-caspase 3蛋白，與對照組相比，在高溫組豬睪丸間質和睪丸生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白細胞百分比顯著升高(圖4E，A1與B1，A2與B2之間差異顯著，P<0.05)，其中，睪丸間質細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白細胞百分比由8.5%升高至32.5%，升高2.8倍，高溫組睪丸生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白細胞百分比由3.5%升高至29.8%，升高7.5倍，相比間質細胞升高更為明顯。

睪丸組織Nrf2蛋白免疫組織化學染色：A.對照組；A1.對照組睪丸間質細胞染色；A2.對照組睪丸生精上皮染色；B.高溫組；B1.高溫組睪丸間質細胞染色；B2.高溫組睪丸生精上皮染色；→.Nrf2蛋白染色的睪丸間質細胞，紅色長方形代表Nrf2在睪丸間質細胞表達，黃色長方形代表Nrf2在睪丸生精上皮細胞表達，棕色為蛋白陽性表達，藍色為細胞核染色。ipp軟件增強睪丸組織Nrf2蛋白免疫組織化學染色為紅色：C.對照組；D.高溫組；E.ipp軟件分析對應睪丸不同區域A1、A2、B1和B2的Nrf2蛋白染色的平均光密度。*.A1和B1、A2和B2，P<0.05。下同Immunohistochemical detection of Nrf2 in the thermal neutral group (A) and the heat-treated group (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of Nrf2 in testicular interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1)，and immunohistochemical detection of Nrf2 in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2). The immunohistochemical signal appears brown; the counterstained background appears blue. →.Stained interstitial cells. E.The quantitative evaluation of mean density of Nrf2 immunostaining in interstitial cells and seminiferous epithelium of the thermal neutral group (C) and the heat-treated group (D)，and Nrf2 immunostaining areas are highlighted in red colour. *.A1 and B1，A2and B2,P<0.05. The same as below

圖2 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達的影響Fig.2 Effect of high ambient temperature on the testicular Nrf2 protein expression in Bama miniature pig

睪丸組織HO-1蛋白免疫組織化學染色：A.對照組；A1.對照組睪丸間質細胞染色；A2.對照組睪丸生精上皮染色；B.高溫組；B1.高溫組睪丸間質細胞染色；B2.高溫組睪丸生精上皮染色；→.HO-1蛋白染色的睪丸間質細胞，紅色長方形代表HO-1在睪丸間質細胞表達，黃色長方形代表HO-1在睪丸生精上皮細胞表達，棕色為蛋白陽性表達，藍色為細胞核染色。ipp軟件增強睪丸組織HO-1蛋白免疫組織化學染色為紅色：C.對照組；D.高溫組；E.ipp軟件分析對應睪丸不同區域A1，A2，B1，B2的Nrf2蛋白染色的平均光密度Immunohistochemical detection of HO-1 in the thermal neutral group (A) and the heat-treated group (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of HO-1 in testicular interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1)，and immunohistochemical detection of HO-1 in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2). The immunohistochemical signal appears brown. The counterstained background appears blue. →, stained interstitial cells. E. The quantitative evaluation of mean density of HO-1 immunostaining in interstitial cells and seminiferous epithelium of the thermal neutral group (C) and the heat-treated group (D), and HO-1 immunostaining areas are highlighted in red colour

圖3 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of high ambient temperature on the testicular HO-1 protein expression in Bama miniature pig

睪丸組織細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞：A.對照組；A1.對照組睪丸間質細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞；A2.對照組睪丸生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞；B.高溫組；B1.高溫組睪丸間質細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞；B2.高溫組睪丸生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞；→.睪丸間質細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞；↑.生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞；紅色長方形代表c-caspase 3在睪丸間質細胞表達，黃色長方形代表c-caspase 3在睪丸生精上皮細胞表達，棕色表示c-caspase 3蛋白陽性表達。E.睪丸不同區域A1，A2，B1，B2的細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞百分比Percentage of cellswith c-caspase 3-positive nucleuses in the thermal neutral group and the heat-treated group. Sections of control (A) and heated testes (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of c-caspase 3-positive interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1)，and immunohistochemical detection of c-caspase 3-positive germ cells in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2).→.c-caspase 3-positive interstitial cells；↑.c-caspase 3-positive germ cells；The positive cells appear brown in colour. E. The percentage of positive cells in the thermal neutral group and the heat-treated group

圖4 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞百分比的影響Fig.4 Effect of high ambient temperature on percentage of cells with the c-caspase 3-positive nucleuses in testes of Bama miniature pig

3 討 論

3.1 環境高溫對巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度分布影響

豬皮膚表面溫度受自身體溫和外界環境的雙重影響，一般距離體核較遠，皮毛較少，散熱面積較大部位，變化較大。如果環境溫度高于體表溫度，機體蒸發散熱須排除體內產熱和自然得熱，才能維持體溫正常，只有汗腺機能發達的靈長類可以通過加強蒸發散熱維持體溫正常，一般家畜很難維持體溫恒定[11]。豬汗腺不發達，高溫環境主要通過加強呼吸道蒸發散熱維持體溫，如果高溫持續時間較久，便很難維持體溫恒定。余進等[12]將中國實驗用小型豬暴露于高于豬體表溫度40 ℃的環境溫度中，與暴露之前相比豬體表溫度和直腸溫度顯著升高，表現呼吸急促，排尿減少，喜飲水或滾臥糞尿。Li等[13]利用FLUKE TiR27紅外成像儀對高溫環境中小鼠的體表溫度和陰囊溫度測定發現，體表溫度和陰囊溫度顯著升高，同時直腸溫度也顯著升高。對夏季高溫期間公豬直腸溫度和陰囊皮膚溫度測定發現，當環境溫度處于35 ℃時，公豬直腸溫度升高幅度接近1 ℃，陰囊皮膚溫度升高幅度接近3.5 ℃[14]。在本試驗中，高溫組豬體表溫度和陰囊表面平均溫度顯著升高，陰囊皮膚溫度仍舊明顯低于體表皮膚溫度，但陰囊皮膚升高溫度幅度>體表溫度升高幅度。由于豬陰囊皮膚有豐富的汗腺，并且肉膜能在氣溫升高時變松弛使陰囊變薄，而豬皮膚汗腺退化，所以在高溫時陰囊皮膚較體表皮膚蒸發散熱更強，使得高溫組陰囊皮膚溫度仍低于體表溫度。同時，本試驗也表明當環境溫度高于一定值后，陰囊的熱調節功能達到極致，隨著體核溫度升高睪丸溫度也伴隨升高，陰囊皮膚溫度升高幅度變大。

3.2 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達影響

抗氧化信號通路Nrf2/ARE (antioxidant responsive element, ARE)是機體抵抗內外環境應激的重要防御性轉導通路之一。細胞正常代謝時，轉錄因子Nrf2在細胞質和細胞核中含量處于相對穩定狀態。當細胞處于環境應激狀態時，細胞質中的Nrf2轉位入核，使細胞核中Nrf2含量升高，增加其與核內抗氧化應答元件上GCTGAGTCA位點結合，提高ARE調控的多種解毒酶及抗氧化酶基因表達，增強細胞對環境應激的抗性，進而維持細胞和組織器官內環境穩定[15]。小鼠高溫環境熱應激和小鼠陰囊水浴局部熱應激都能夠顯著誘導睪丸間質細胞和生精上皮細胞中Nrf2蛋白表達，并促使睪丸間質細胞胞質Nrf2蛋白轉位入核[13,16]。利用Western blot方法測定陰囊局部熱應激小鼠睪丸細胞胞質和胞核中Nrf2蛋白表達發現，高溫可促使睪丸細胞中胞質Nrf2向胞核中轉移累積的現象[17]。除此，很多體內外研究也發現Nrf2蛋白不僅在睪丸間質細胞表達，而且在應對外界應激導致的損傷以及維持間質細胞睪酮分泌功能發揮重要作用[8,18]。本研究結果表明，環境高溫顯著增加豬睪丸間質細胞和生精上皮組織Nrf2蛋白表達，其中睪丸間質細胞中Nrf2表達更高，入核現象更明顯。由此可見，豬睪丸間質細胞可高效表達Nrf2蛋白，并且豬在受到高溫環境暴露時會有效激活睪丸間質細胞中Nrf2蛋白通路，這可能在一定程度上維持了睪丸間質細胞的正常功能，緩解高溫誘導的睪丸溫度升高對生精上皮造成的損傷。

3.3 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達影響

HO-1即熱休克蛋白32，能被各種引起細胞氧化應激損傷因素所誘導，包括高氧、缺氧、熱休克、內毒素、過氧化氫、紫外線和重金屬等，其mRNA和蛋白質在組織中的上調表達通常也被認為是氧化應激的標志[7]。在細胞應激發生時，HO-1作為血紅素降解的起始酶和限速酶能快速催化應激誘導紅細胞破壞產生的血紅素，其催化產生的膽綠素、CO以及亞鐵作為體內具有高活性的抗氧化成分，能高效清除細胞內由應激產生的活性氧，維持細胞氧化還原平衡和細胞內環境穩態，緩解血紅素毒性和細胞應激，發揮細胞保護作用[19]。近年研究發現，睪丸間質細胞受到環境應激后，能夠通過上調HO-1的mRNA和蛋白質表達，緩解柴油機納米顆粒物等環境應激引起的細胞凋亡或死亡[20-21]。HO-1可受許多上游信號激活，其中核轉錄因子Nrf2是通過結合ARE序列激活HO-1啟動子，啟動HO-1 mRNA表達。因此，通過Nrf2/ARE信號通路上調HO-1表達也已成為近年研究者攻克細胞氧化應激難題的首要選擇[22]。本研究結果表明，在睪丸組織中，環境高溫主要誘導睪丸間質細胞中HO-1蛋白高水平表達，這說明豬睪丸間質細胞可高效表達HO-1蛋白，并通過啟動HO-1蛋白表達，抵抗環境高溫引起的睪丸組織損傷。考慮到高溫同時誘導了睪丸間質細胞Nrf2蛋白入核，這表明高溫可能是通過激活Nrf2/ARE/HO-1信號通路間接上調HO-1表達，進而發揮細胞保護作用。

3.4 環境高溫對巴馬香豬睪丸組織細胞核陽性表達cleaved caspase 3蛋白細胞百分比影響

一般情況下，有絲分裂活動旺盛的細胞，如癌細胞和生殖細胞，比體細胞更易受到熱應激影響。研究發現細胞存活率和溫度之間存在一定關系，當細胞溫度處于或高于42.5 ℃左右，大多數細胞存活率快速下降，對于生精細胞，溫度超過36.5 ℃時，會導致生精細胞凋亡，當溫度超過43 ℃時，生精細胞則主要表現為壞死[23]。在體內，熱誘導細胞生物學效應在不同細胞的表現也不同，精母細胞和早期精子細胞，不具有熱耐受性，很容易出現細胞凋亡，而支持細胞和間質細胞具有完善的抗氧化體系和較強的熱耐受性，對溫度的敏感性較低[24]。免疫組織化學染色方法測定熱應激大白公豬睪丸組織中c-caspase 3蛋白表達，發現熱應激處理會誘導公豬睪丸支持細胞和間質細胞c-caspase 3蛋白表達，并且大量生精細胞細胞核呈c-caspase 3蛋白陽性著色[25]。本研究結果表明，環境高溫誘導豬睪丸間質和睪丸生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白，并且睪丸生精上皮細胞核陽性表達c-caspase 3蛋白的細胞百分比升高幅度更為明顯，這說明環境高溫可誘導公豬睪丸組織細胞凋亡。由于生精細胞熱耐受性較間質細胞弱，因此睪丸生精上皮細胞比睪丸間質細胞對高溫反應更加敏感，出現凋亡的比例也更多。

4 結 論

本研究表明，豬睪丸組織間質細胞和生精上皮細胞可表達Nrf2蛋白和HO-1蛋白。環境高溫可促進睪丸間質細胞Nrf2蛋白入核，并且高效表達HO-1蛋白。環境高溫會誘導公豬睪丸組織細胞凋亡，其中生精上皮細胞比睪丸間質細胞對高溫更加敏感，出現凋亡比例更多，這可能是由于環境溫度超過了陰囊的最大熱調節功能范圍，隨著體核溫度升高睪丸溫度也伴隨升高，進而引起細胞應激損傷，最終導致豬睪丸組織細胞凋亡增加。同時，激活的Nrf2信號通路和高效表達的HO-1蛋白，是豬睪丸組織通過體內分子途徑緩解高溫環境誘導損傷的有效措施，也給體內尋找解決熱應激導致公豬精液品質下降難題，提供潛在的有效分子靶點。

參考文獻(References)：

[1] 李延森, 曹 云, 王愛華, 等. 南通地區不同品種公豬夏季精液品質變化[J]. 畜牧與獸醫, 2014, 46(10): 40-42.

LI Y S, CAO Y, WANG A H, et al. The changes in boar semen quality of different type strains in the area of Nantong during hot summer[J].AnimalHusbandry&VeterinaryMedicine, 2014, 46(10): 40-42. (in Chinese)

[2] 李延森, 沈祥星, 李春梅. 母豬發情和產仔性能與環境溫度變化相關性分析[J]. 畜牧獸醫學報, 2016, 47(6): 1133-1139.

LI Y S, SHEN X X, LI C M. Correlation analysis between the ambient temperatures and reproductive performance of sows[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2016, 47(6): 1133-1139. (in Chinese)

[3] PAUL C, TENG S, SAUNDERS P T K. A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death[J].BiolReprod, 2009, 80(5): 913-919.

[4] ZHANG M Q, JIANG M, BI Y, et al. Autophagy and apoptosis act as partners to induce germ cell death after heat stress in mice[J].PLoSOne, 2012, 7(7): e41412.

[5] SPORNM B, LIBY K T. Nrf2 and cancer: The good, the bad and the importance of context[J].NatRevCancer, 2012, 12(8): 564-571.

[6] BELLK F, AL-MUBARAK B, FOWLER J H, et al. Mild oxidative stress activates Nrf2 in astrocytes, which contributes to neuroprotective ischemic preconditioning[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011, 108(1): E1-E2.

[7] SOARESM P, BACH F H. Heme oxygenase-1: From biology to therapeutic potential[J].TrendsMolMed, 2009, 15(2): 50-58.

[8] SHEN B, WANG W, DING L, et al. Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 rescues the oxidative stress induced by di-N-butylphthalate in testicular Leydig cells[J].HumExpToxicol, 2015, 32(2): 145-152.

[9] SHIRAISHI K, NAITO K. Increased expression of Leydig cell haem oxygenase-1 preserves spermatogenesis in varicocele[J].HumReprod, 2005, 20(9): 2608-2613.

[10] BAE W J, HA U S, CHOI J B, et al. Protective effect of decursin extracted from Angelica gigas in male infertility via Nrf2/HO-1 signaling pathway[J].OxidMedCellLongev, 2016, 2016: 5901098.

[11] 顏培實, 李如治. 家畜環境衛生學[M]. 北京: 高等教育出版社, 2011.

YAN P S, LI R Z. Domestic animals and environmental hygiene[M]. Beijing: China Higher Education Press, 2011. (in Chinese)

[12] YU J, YIN P, LIU F H, et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study[J].CompBiochemPhysiolA, 2010, 156(1): 119-128.

[13] LI Y S, HUANG Y, PIAO Y G, et al. Protective effects of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 on whole body heat stress-induced oxidative damage in the mouse testis[J].ReprodBiolEndocrin, 2013, 11: 23.

[14] LI Y S, WANG A H, TAYA K, et al. Declining semen quality and steadying seminal plasma ions in heat-stressed boar model[J].ReprodMedBiol, 2015, 14(4): 171-177.

[15] MAHER J, YAMAMOTO M. The rise of antioxidant signaling-the evolution and hormetic actions of Nrf2[J].ToxicolApplPharmacol, 2010, 244(1): 4-15.

[16] LI Y S, CAO Y, WANG F, et al. Scrotal heat induced the Nrf2-driven antioxidant response during oxidative stress and apoptosis in the mouse testis[J].ActaHistochem, 2014, 116(5): 883-890.

[17] LI Y S, CAO Y, WANG F, et al.Tert-butylhydroquinone attenuates scrotal heat-induced damage by regulating Nrf2-antioxidant system in the mouse testis[J].GenCompEndocrinol, 2014, 208: 12-20.

[18] CHEN H L, JIN S Y, GUO J J, et al. Knockout of the transcription factorNrf2: Effects on testosterone production by aging mouse Leydig cells[J].MolCellEndocrinol, 2015, 409: 113-120.

[19] STOCKER R. Induction of haem oxygenase as a defence against oxidative stress[J].FreeRadicResCommun, 1990, 9(2): 101-112.

[20] KOMATSU T, TABATA M, KUBO-IRIE M, et al. The effects of nanoparticles on mouse testis Leydig cellsinvitro[J].Toxicolinvitro, 2008, 22(8): 1825-1831.

[21] OZAWA N, GODA N, MAKINO N, et al. Leydig cell-derived heme oxygenase-1 regulates apoptosis of premeiotic germ cells in response to stress[J].JClinInvest, 2002, 109(4): 457-467.

[22] ALAM J, COOK J L. How many transcription factors does it take to turn on the heme oxygenase-1 gene?[J].AmJRespirCellMolBiol, 2007, 36(2): 166-174.

[23] AGARWAL A, JOHN A R, ALVAREZ J G. Studies on men’s health and fertility[M]. New Jersey: Humana Press, 2012.

[24] HARDY M P, GANJAM V K. Stress, 11β-HSD, and Leydig cell function[J].JAndrol, 1997, 18(5): 475-479.

[25] 范小瑞, 張 禛, 席華明, 等. 熱應激對豬睪丸Cyt-C和Caspase-3表達的影響[J]. 中國農業科學, 2017, 50(5): 924-931.

FAN X R, ZHANG Z, XI H M, et al. Effect of heat stress on the expression of Cyt-C and Caspase-3 in boar testis[J].ScientiaAgriculturaSinica, 2017, 50(5): 924-931. (in Chinese)