穩定表達SLAM受體的Vero和BHK21細胞系的建立及其對犬瘟熱病毒分離效果的比較

朱 璐，燕 霞，代 科，王正皓，趙玉佳，楊 振，文心田，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文翼平*(.四川農業大學動物醫學院豬病研究中心，成都 630；.成都大熊貓繁育研究基地，成都 6008)

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的犬瘟熱病毒(canine distemper virus, CDV)引起的在食肉目動物中廣泛傳播的急性高度接觸性傳染病[1-3]。CDV給犬、貂等經濟動物養殖業和大熊貓等特種動物的保護及生物多樣性帶來極大損失，其社會公共危害性越來越受到人們重視[4]。犬瘟熱病毒對外界環境特別敏感，分離病毒不易，嚴重制約對CDV的深入研究。有學者利用Vero細胞系、MDCK細胞系和倉鼠細胞系BHK21分離CDV，需要盲傳多代才有可能觀察到細胞病變(cytopathic effect, CPE)，且不是所有CDV毒株感染Vero細胞和BHK21細胞后都能產生CPE，能適應Vero細胞生長的CDV多為疫苗株(如Onderstepoort株)，野毒株很少能適應Vero細胞和BHK21細胞[4]。也有報道稱隨著野毒株適應以上細胞生長，會導致天然毒力丟失[5]，且在Vero、MDCK和BHK21等細胞上傳代的CDV基因容易發生突變[6]。近年來研究人員發現信號淋巴激活分子(signaling lymphocyte activation molecule，SLAM 又稱 CD150)是麻疹病毒屬的病毒受體[5，7]。Seki等[8]構建表達犬SLAM受體的Vero細胞系(Vero.DogSLAMtag)，更容易使犬源的CDV在Vero.DogSLAMtag細胞系上產生病變，并且不會導致病毒變異，表達犬SLAM受體的Vero細胞系可以在接種病料24 h后高效率地分離到CDV，利用Vero.DogSLAMtag細胞和B95a細胞對野生型CDV的分離率分別為71%和43%，表明存在較大差異。

SLAM主要在人和動物的胸腺、激活淋巴細胞、成熟樹突狀細胞、巨噬細胞等細胞中表達[9]，在未成熟樹突狀細胞、粒細胞、單核細胞、紅細胞和血小板中無法有效進行檢測[10]。在非淋巴器官(如小腸、腎、腦和心)中也都沒有檢測到SLAM mRNA的表達[11]。有學者報道，麻疹病毒的感染可引起SLAM的表達水平上調[12]，但麻疹病毒感染過程中SLAM表達量趨于穩定[13]，表達量不會隨著感染時間變化而變化。另一項研究感染組SLAM表達量顯著高于未感染對照組，表明CDV感染引起SLAM表達的上調[14]。本研究擬從CDV陽性犬外周血中分離淋巴細胞，獲取SLAM基因，構建穩定表達CDV受體SLAM的Vero細胞系和BHK21細胞系，比較兩者對于臨床CDV分離的敏感性，確定能夠在體外快速分離CDV野毒株的細胞系，為其毒力及致病性等相關研究提供可靠的生物材料和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 Vero細胞系、BHK21細胞系、pcDNA3.1(-)質粒均由本實驗室保存，2017年來源于四川省成都市區、大邑縣、都江堰的3份犬CDV的陽性病料由本實驗室保存于-80 ℃冰箱。Pcaggs-HA真核表達載體購自西南地區淼靈質粒生物公司。

1.1.2 主要試劑和儀器XhoⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、SalⅠ等限制性內切酶、mini BEST Universal RNA Extraction Kit、高保真聚合酶、反轉錄試劑盒、PCR擴增體系 Premix-Taq酶(TaKaRa公司)；Histopaque-1077淋巴細胞分離液(SIGAMA公司)；One step Cloning Kit(vazyme 公司)；無內毒素質粒提取試劑盒(OMEGA公司)；胎牛血清、DMEM和G418(Invitrogen 公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒(WizardSV Gel and PCR Clean-up system)(Promega公司)；轉染試劑Lipofectamine 2000(Life Technologies公司)；CDV-NP-MAB(VMRD公司)；兔anti-HA-tag抗體(Abcam公司)；FITC(Fluorescein Isothiocyanate)異硫氰酸熒光素標記山羊抗兔IgG(生工公司)；PAGE凝膠制備試劑盒(佰合科技公司)；凝膠成像系統(BIO-RAD)；熒光倒置顯微鏡(尼康)。

1.1.3 引物的合成 犬SLAM受體引物、擴增Neo基因引物和鑒定CDV特異性引物均由TaKaRa公司合成。引物序列如表1所示。

表1引物序列

Table1Sequenceofprimers

引物Primer序列(5′→3′)SequenceS?FGCGAATTCATGGATTCCAGGGGCTTCS?RGCAGATCTTCAGCTCTCTGGGAACGTCACNo?S?FGCCTCGAGACAGGGAGAGCTTGATGATNeo?F?SalⅠAAAAGTGCCACCTGGGTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAGTNeo?R?SalⅠTAGTCAATAATCAATGTCGACTCAGAAGAACTCGTCAAGA1GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAAA2CTTGAGCTTTCGACCCTTCP1CGGAAATCAACGGACCTAAATP2TCCTTGAGCTTTCGACCCTT

1.2 Pcag-SLAM表達載體的構建

1.2.1 Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA表達載體的構建 以pcDNA3.1(-)為模板，以Neo-F-SalⅠ和Neo-R-SalⅠ為引物進行PCR擴增含SV40啟動子的Neo基因，PCR反應體系：高保真聚合酶12.5 μL，上下游引物各1.5 μL，質粒模板2 μL，ddH2O補齊25 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 40 s，34個循環；72 ℃ 10 min。獲取Neo基因PCR擴增產物，并利用純化試劑盒純化PCR產物。限制性內切酶SalⅠ單酶切線性化Pcaggs-HA載體并純化，利用同源重組的方法將純化產物Neo基因插入單酶切線性化Pcaggs-HA載體的SalⅠ酶切位點。反應體系與試驗步驟按One step Cloning Kit說明書操作。將反應產物冷卻后轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，將轉化獲得的菌液涂于含抗生素的培養基中培養12 h，挑單個細菌至LB培養基中擴大培養，并通過PCR和酶切的方法鑒定插入片段正確后，在Pcaggs-Neo-HA載體的多克隆位點EcoRⅠ和XhoⅠ之間插入含有Igk鏈信號肽和HA標簽的28個氨基酸(H2-METDTLLLWVLLLWVPGSTGDYPYDVPD-COOH)的基因片段GAATTCGCCACCATGGAGACAGA-CACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGG-GTTCCAGGTTCCACTGGTGACTATCCATATG-ATGTTCCAGATTATGCTGGGGCCCTCGAG，構建Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體。

1.2.2SLAM基因的克隆和Pcag-SLAM真核表達載體的構建 無菌采集CDV陽性犬外周抗凝血20 mL，按照Histopaque-1077淋巴細胞分離液說明書操作分離外周血淋巴細胞。按TaKaRa的RNA提取試劑盒說明書提取犬外周血淋巴細胞總mRNA，應用反轉錄試劑合成cDNA后，用S-F/S-R引物對擴增犬SLAM基因。將犬SLAM基因克隆到pMD18-T Simple 載體上，克隆的基因片段送生工生物工程公司測序后與NCBI GenBank已經發表的犬SLAM的DNA序列(AF325357)比對正確后，通過網站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測出SLAM基因的信號肽，然后設計去信號肽的引物no-S-F和S-R擴增去信號肽的SLAM基因片段，將克隆的去信號肽的SLAM基因片段插入到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA的多克隆位點XhoⅠ和BglⅡ之間，通過PCR、酶切等方法鑒定插入片段的方向正確后，構建得到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA-SLAM真核表達載體，命名為Pcag-SLAM。

1.3 G418篩選濃度的確定

在25 cm2細胞瓶培養生長狀態良好的Vero細胞和BHK21細胞，經胰酶消化、離心后棄去上清液，用12 mL含10% FBS的DMEM培養基重懸細胞，將細胞懸液加至12孔細胞培養板，5% CO2，37 ℃ 培養箱培養待細胞長滿單層，棄去培養基，用PBS清洗2次，更換不同質量濃度梯度G418的DMEM篩選培養基(質量濃度依次為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0 mg·mL-1)，每個梯度設4個重復孔。每3 d更換一次篩選培養基，連續培養14 d，每天觀察細胞死亡情況，以第7天細胞全部死亡的最低G418濃度為最適篩選濃度。以第14天細胞全部死亡的G418濃度的1/2為維持培養濃度。

1.4 Vero細胞和BHK21細胞的轉染及克隆篩選

1.4.1 Vero細胞和BHK21細胞轉染Pcag-SLAM真核表達載體 無血清無抗生素DMEM培養基稀釋Pcag-SLAM重組質粒，質量濃度達到1 500 ng·μL-1以后，參照Lipofectamine?2000 Reagent轉染試劑說明書同時轉染長至90%的Vero細胞和BHK21單層細胞，轉染24 h后更換含2% FBS和篩選濃度G418的DMEM培養基，同時設置轉染對照組，待對照組細胞全部死亡，對轉染的細胞消化傳代，通過RT-PCR鑒定細胞是否轉染成功。

1.4.2 SLAM-Vero細胞及SLAM-BHK21細胞單克隆篩選 PCR鑒定SLAM陽性的SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞分別鋪于96孔板，每孔添加篩選濃度的G418，2% FBS DMEM培養基，用稀釋篩選法篩選出單克隆的SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞，經間接免疫熒光法鑒定，確定篩選出穩定表達SLAM受體的Vero細胞和BHK21細胞，分別命名為SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞。

1.4.3 SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞間接免疫熒光鑒定 在12孔板中分別接種篩選得到的單克隆SLAM-Vero 細胞和SLAM-BHK21細胞，以及普通Vero細胞、BHK21細胞，棄去培養液，用PBS清洗2次，每孔加入500 μL 4% PFA(多聚甲醛)固定液4 ℃ 固定12 h，棄上清，PBS清洗3次，棄上清，每孔加入500 μL 0.25% TritonX 100/PBS 4 ℃ 作用12 h，棄上清，PBST清洗3次；用300 μL 5% BSA封閉液，4 ℃封閉12 h，之后對抗兔anti-HA一抗進行稀釋，每孔加入350 μL稀釋好的一抗，4 ℃作用12 h；用PBS稀釋的FITC 標記山羊抗兔IgG二抗，每孔加入350 μL的二抗，37 ℃ 作用45 min，棄上清，PBST清洗3次，每孔滴加10 μL含DAPI封片劑。用熒光顯微鏡觀察并且存照。

1.4.4SLAM基因轉錄和蛋白表達的鑒定 選取間接免疫熒光鑒定結果最亮的SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞克隆株連續傳代，將第10、20、50代細胞凍存。凍存細胞復蘇傳代后提取其mRNA，反轉錄后，用no-S-F/S-R引物對檢測SLAM基因mRNA，并用HA-tag MAb對SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞的SLAM基因融合蛋白表達進行Western blot 鑒定。

1.5 利用不同組織分離CDV 的情況比較

選擇3只不同時間不同地點來源CDV陽性犬，取其肺、腦、脾、淋巴、腸內容物這5種病料加液氮研磨，然后加雙抗和DMEM(體積比1∶1∶8)制成細胞懸液，經3凍3融處理后4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，將上清轉入新離心管，用0.22 μm的濾器過濾除菌，分別取1 mL濾液接種SLAM-Vero 細胞、Vero細胞、SLAM-BHK21細胞和BHK21細胞，置于CO2培養箱37 ℃孵育1.5 h后，棄上清，PBS洗2次，更換含2% FBS，維持濃度 G418的DMEM培養基，培養5 d收毒后繼續接毒傳代，同時設置不經處理的SLAM-Vero 細胞、Vero細胞、SLAM-BHK21細胞和BHK21細胞作為對照組。每代收毒后均用引物(A1/A2和P1/P2)進行RT-PCR鑒定，結果為陽性的一直傳代,直至出現穩定的CPE。

1.6 CDV分離株間接免疫熒光鑒定(IFA)

將本研究分離到的三株CDV接種到SLAM-Vero單層細胞中，并設置陰性對照組，于37 ℃，5% CO2培養48 h后，棄細胞培養液將細胞單層固定，通透和封閉后，以抗CDV-NP MAb為一抗，FITC標記山羊抗鼠IgG為二抗進行IFA鑒定，最后滴加DAPI進行細胞核染色。

2 結 果

2.1 Pcag-SLAM表達載體的構建

按“1.2.1”的方法將擴增到的含SV40啟動子的Neo基因和Igk-HA氨基酸的編碼序列插入到Pcaggs-HA表達載體，用PCR方法擴增Neo基因和Igk-HA基因，并將產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明在1 259 bp處出現Neo特異性擴增片段，在120 bp處出現Igk-HA特異性擴增片段，二者均與預期結果相符(圖1)。Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體具有抗新霉素活性，能用于轉染后陽性細胞篩選；含有的HA標簽可用于外源蛋白鑒定；Igk鏈信號肽能增強外源蛋白表達，并使表達外源蛋白錨定在細胞膜表面。按照“1.2.2”的方法從CDV陽性犬的外周血內提取到SLAM受體，并將其克隆到pMD18-T Simple 載體上，經生工生物公司測序正確后再擴增去信號肽的SLAM基因片段，并將其插入到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體內，構建得到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA-SLAM真核表達載體，命名為Pcag-SLAM。SLAM基因 cDNA PCR擴增結果如圖2所示。

M、M1. DNA相對分子質量標準；1～6. SV40 Neo基因片段(1 259 bp)； 8～10. Igk-HA基因片段(120 bp)；7、11. 陰性對照M. DNA marker DL5000; M1. DNA marker DL1000 ; 1-6. SV40 Neo gene fragment; 8-10. Igk-HA gene fragment; 7, 11. Negative control

圖1 含SV40啟動子的Neo基因擴增和Igk-HA基因擴增結果Fig.1 Amplification of Neo gene with SV40 promoter and amplification of Igk-HA gene

M. DNA相對分子質量標準；1. 陰性對照；2～5.去信號肽的SLAM基因cDNAM. DNA marker DL5000; 1. Negative control; 2-5. SLAM gene without signaling peptide cDNA

圖2 去信號肽的SLAM基因RT-PCR產物電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of SLAM gene without signaling peptide RT-PCR products

2.2 G418篩選濃度的確定

Vero細胞加入含不同質量濃度G418的培養液，培養至第4天，1.6 mg·mL-1組30%的細胞死亡，2.2 mg·mL-1組60%的細胞死亡，2.4 mg·mL-1組90%的細胞死亡，2.8 mg·mL-1組98%的細胞死亡，3.0 mg·mL-1組細胞全部死亡；培養至第14天，2.0 mg·mL-1組細胞全部死亡，則確定Vero細胞的G418最適篩選濃度為3.0 mg·mL-1，G418維持濃度為1.0 mg·mL-1。用同樣的方法得到確定BHK21細胞G418最適篩選濃度為2.2 mg·mL-1，維持濃度為0.8 mg·mL-1。

2.3 Vero細胞和BHK21細胞轉染及克隆篩選

Pcag-SLAM重組質粒轉染至Vero細胞和BHK21細胞后通過RT-PCR的方法初次鑒定SLAM基因的表達后，通過G418壓力篩選與稀釋篩選法結合，篩選出穩定表達SLAM受體的Vero細胞和BHK21細胞，以HA-tag MAb為一抗，通過間接免疫熒光法(圖3)和Western blot(圖4)鑒定SLAM受體的表達。間接免疫熒光法結果顯示SLAM基因傳代至F50代都可以穩定地表達，Western blot結果表明在49.5和39 ku處可以檢測到2個蛋白質，蛋白質大小與預期結果一致。

2.4 利用不同細胞接種不同病料分離CDV情況的比較

3只CDV陽性犬分別命名DJY-5.4、CD-5.7和DY-6.3，每只犬取肺、脾、腦、淋巴、腸內容物5種共15份病料按“1.5”的方法分別接種在SLAM-Vero細胞、Vero細胞、SLAM-BHK21細胞和BHK21細胞上分離CDV，最終CD-5.7-肺，DY-6.3-肺和DY-6.3-脾在SLAM-Vero細胞分離到CDV，且分離株均可以在細胞上產生明顯穩定的病變(圖5), SLAM-Vero細胞在接毒后12 h出現融合體細胞，呈現多核巨細胞樣，第24小時細胞融合處出現星狀收縮，培養至72 h有細胞脫落。CD-5.7-肺和DY-6.3- 肺在傳代第6代出現明顯病變，DY-6.3-脾在第3代出現明顯病變，分離株通過引物A1A2和引物P1P2進行鑒定，結果與預期相符，證實其為CDV(圖6)。而其余組織(腦、淋巴、腸內容物)在SLAM-Vero細胞上傳代2次后RT-PCR檢測結果均為陰性，無法繼續傳代。所有15份病料在SLAM-BHK21細胞、BHK21細胞以及Vero細胞上均無法進行增殖傳代。

A. BHK21細胞(60×)； B. SLAM-BHK21細胞(60×)；C. F50代SLAM-BHK21細胞(60×)；D. Vero細胞(60×；E. SLAM-Vero細胞(60×)；F. F50代SLAM-Vero細胞(60×)；Bar=10 μmA. BHK21 cell (60×); B. SLAM-BHK21 cell (60×); C. The F50 passage of SLAM-BHK21 cells transfected stably (60×); D. Vero cell (60×); E. SLAM-Vero cell (60×); F. The F50 passage of SLAM-Vero cells transfected stably (60×); Bar=10 μm

圖3 SLAM基因融合蛋白IFA鑒定Fig.3 SLAM gene fusion protein expression in SLAM-Vero cell and SLAM-BHK21 cell based on HA MAb Indirect immunofluorescence assay

M. 蛋白質相對分子質量標準；1. SLAM-BHK21細胞；2. F50代SLAM-BHK21細胞；3. SLAM-Vero細胞；4. F50代SLAM-Vero細胞；5. BHK21細胞；6. Vero細胞M. Protein molecular weight marker; 1. SLAM-BHK21 cells; 2. The F50 passage of SLAM-BHK21 cells; 3. SLAM-Vero cells; 4. The F50 passage of SLAM-Vero cells; 5. BHK21 cells; 6. Vero cells

圖4 Western blot法鑒定SLAM-BHK21細胞和SLAM-Vero細胞的SLAM基因融合蛋白表達情況Fig.4 Western blot identification of SLAM gene fusion protein in SLAM-BHK21 cells and SLAM-Vero cells

2.5 CDV的IFA鑒定結果

以CDV-NP MAb作為一抗，FITC標記山羊抗小鼠IgG為二抗，對分離株進行IFA鑒定，結果顯示分離株感染SLAM-Vero細胞出現綠色熒光(圖7)，普通Vero細胞接毒后無特異性熒光，正常SLAM-Vero對照組細胞無特異性熒光，進一步表明該分離株為CDV。

A. SLAM-Vero細胞對照組120 h；B. Vero細胞接毒后120 h；C. SLAM-Vero細胞接毒后12 h；D. SLAM-Vero細胞接毒后120 hA. SLAM-Vero cell negative control 120 hpi; B. Vero cell inoculated with CDV 120 hpi; C. SLAM-Vero cell inoculated with CDV 12 hpi; D. SLAM-Vero cell inoculated with CDV 120 hpi

圖5 Vero細胞和SLAM-Vero細胞接種犬瘟熱病毒后CPE圖(20×)Fig.5 CPE of Vero and SLAM-Vero cell inoculated by CDV positive samples (20×)

A. A1A2引物鑒定CDV(335 bp)；B. P1P2引物鑒定CDV(242 bp)；M. DNA相對分子質量標準；1. CD-5.7-肺；2. DY-6.3-肺；3. DY-6.3-脾；4. 陰性對照A. Identification of CDV by A1A2 primer (335 bp)；B. Identification of CDV by P1P2 primer (242 bp)；M. DL5000 DNA marker; 1. CD-5.7-lung; 2. DY-6.3-lung; 3. DY-6.3-spleen; 4. Negative control

圖6 CDV的 RT-PCR電泳結果Fig.6 Electrophoresis of RT-PCR product of CDV

A. CDV 感染SLAM-Vero細胞(10×)；B、C. CDV 感染SLAM-Vero細胞(40×)，藍色為細胞核A. SLAM-Vero inoculated with CDV(10×); B, C. SLAM-Vero inoculated with CDV(40×), the nucleus DAPI stained blue

圖7 CDV的IFA鑒定結果Fig.7 IFA identification results of CDV

3 討 論

CDV的分離通常通過原代細胞和傳代細胞來進行，原代細胞包括犬巨噬細胞、犬淋巴細胞等，但原代細胞可傳代次數少且不容易獲得，不利于病毒的保存[15]；傳代細胞主要有Vero細胞、MDCK細胞、BHK21細胞等，通常適應了這些細胞的毒株多數為疫苗株，例如Onderstepoort 株和Rockborn株，但這些細胞不利于野毒株的分離[16]。通常，當CDV野毒株適應了沒有CDV受體SLAM的細胞進行培養，會導致病毒的天然毒力丟失[17]。近年來許多研究已經證實，SLAM是表達在宿主免疫細胞膜上的一種糖蛋白[18]，是麻疹病毒屬病毒的淋巴細胞趨向性、宿主特異性和組織趨向性的主要決定因素之一[19-20]。Seki等[8]證明表達SLAM的Vero細胞比B95a細胞對CDV更敏感，表達SLAM的Vero細胞系是CDV的理想宿主。他們構建的表達SLAM的Vero細胞可以利用脾分離到CDV[8]，本研究構建的SLAM-Vero細胞系利用脾和肺均可以分離到CDV。目前在國內表達SLAM受體的SLAM-Vero細胞系仍未商品化，在此之前，本人利用無SLAM受體的Vero細胞分離CDV，很長時間一直未分離到CDV野毒株，構建成功該細胞系后，很順利地分離到2株野生型CDV，因此構建一株SLAM-Vero細胞系對CDV的研究顯得尤為重要。

本研究從犬瘟熱陽性犬的外周血中提取淋巴細胞，并成功擴增到SLAM基因。通過分子克隆技術將去信號肽的SLAM基因片段插入到Pcaggs-Neo-HA-Igk-HA載體，構成Pcaggs-HA-Neo-Igk-HA-SLAM真核表達載體，命名為Pcag-SLAM。該載體存在兩個HA-tag用于SLAM-HA融合蛋白表達情況的檢測，每個HA-tag前各有一個啟動子，兩個HA-tag和SLAM基因共用一個終止子，若SLAM基因無法表達，則檢測不到任何蛋白；當SLAM-HA融合蛋白完全表達的情況下可檢測到與預期一致，大小分別是39和49.5 ku的2個HA蛋白。

本研究在培養時間、分離方法均相同的條件下，利用兩種表達SLAM受體的細胞系分離CDV野毒株，比較兩種細胞在CDV野毒株分離時的敏感性，結果表明，3例犬瘟熱病例中有2例可以利用SLAM-Vero細胞分離到CDV，且在接毒后12 h就可看到明顯的細胞病變。而這三例CDV均無法在SLAM-BHK21細胞上生長。出現這一結果可能的原因是CDV有兩個包膜糖蛋白，分別是血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)，這兩個蛋白共同介導病毒與細胞受體結合以及膜融合[21-22]，由于CDV野毒株基因的不同，導致對不同細胞的親和性有差異[20]。本研究分離到的2株CDV野毒株可以在SLAM-Vero細胞上穩定地生長，而無法在SLAM-BHK21細胞上生長，說明還有未知的蛋白或者氨基酸位點影響CDV對不同細胞系的親和力。本實驗室仍繼續利用這兩種細胞系分離野毒株，根據現有研究的結果顯示表達SLAM受體的Vero細胞系較表達SLAM受體的BHK21細胞系對本地區CDV野毒株的分離率相對較高。

Qiao等[23]利用一只犬的肺分離出一株CDV強毒株。趙建軍等[24]利用犬的肺和脾在表達犬SLAM受體的Vero細胞分離出一株CDV。本研究將3只CDV陽性犬的肺、脾、淋巴結、大腦、腸內容物經處理后，將上清接種于SLAM-Vero細胞和SLAM-BHK21細胞，最終從肺和脾分離出病毒，而淋巴結、大腦和腸內容物雖然可以通過RT-PCR檢測到特異性擴增片段，但體外分離效果不理想，這也許與病毒的組織趨向性有關。

4 結 論

成功構建了表達犬瘟熱病毒受體SLAM的SLAM-Vero細胞系和SLAM-BHK21細胞系，通過對其接種3株不同來源的犬瘟熱臨床樣本的5種不同組織，發現在分離CDV野毒株時選擇肺和脾更容易在表達SLAM受體的細胞系上分離出病毒。同時發現SLAM-Vero細胞比SLAM-BHK21細胞對CDV野毒株的分離率高，且病變明顯，為CDV野毒株的快速分離與研究提供了有效的工具。

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