變異豬流行性腹瀉病毒M和N融合雙基因的原核表達及表達產物免疫原性分析

王隆柏，王晨燕，吳學敏，陳秋勇，車勇良，陳如敬，周倫江(福建省農業科學院畜牧獸醫研究所/福建省畜禽疫病防治工程技術研究中心，福州 350013)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性、高度接觸性的腸道疾病，主要導致各階段發病豬群腹瀉、嘔吐、脫水或死亡，是目前導致哺乳仔豬發生腹瀉死亡的全球性疫病之一[1-2]。該病自1978年英國首次報道[3]，隨后世界各國均有發生。我國于1980年首次報道PED，并陸續有該病的發生。從2007年以來，因PEDV的基因發生了變異，PEDV又開始在泰國、韓國和越南等國家流行，隨后蔓延至日本、中國、加拿大和美國等養豬國家[4-6]，導致該病再次暴發，席卷全球。由于該病來勢兇猛，且臨床癥狀比以往更為嚴重，哺乳仔豬的發病率高達100%，死亡率在80%以上，尤其是對7日齡以內的仔豬危害嚴重[7]，死亡率高達100%。PEDV為冠狀病毒科，冠狀病毒屬的成員，主要含有4個結構蛋白，分別為S、M、N及E蛋白。雖然M和N基因相對比較保守，但與經典毒株CV777以及早些年份的毒株相比較，其氨基酸也發生了部分變異，遺傳進化樹也不在一個分支上[8-11]。目前，已見利用經典PEDV的單個基因(如N、M及S1基因片段)，表達出單基因蛋白[1，12]，并測定出蛋白具有免疫原性。在雙基因表達方面，未見通過變異PEDV的M和N基因片段，利用原核表達載體，通過無縫克隆技術，構建出PEDV的pE2-S-N的融合雙基因原核表達質粒。因此，一種構建PEDV的M-N融合雙基因表達載體方法的建立，對今后開展該病的診斷技術和免疫研究，具有重要意義和應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、pEASY-Blunt E2(pE2)原核表達載體、pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Kit、dNTPs、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStart KD Plus Buffer、TransStart KD Plus DNA Polymerase、Trans1-T1感受態細胞、轉染試劑等主要試劑均購自北京全式金生物技術有限公司；羊抗兔IgG-HRP酶和羊抗鼠IgG-HRP酶購自武漢博士德；BLAB/c鼠購自吳氏試驗動物公司；10%分離膠和轉印膜購自碧云天公司；變異PEDV-FJFQ2014毒株(GenBank登陸號KJ646580)、M蛋白高免血清、N蛋白高免血清及PEDV兔抗高免血清由本科室制備保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據變異PEDV 的M、N基因片段，結合pE2表達載體的引物序列，設計合成引物序列，具體見表1。

表1引物序列

Table1Thesequenceofprimer

片段Fragment引物序列(5′→3′)Sequenceofprimer退火溫度/℃Annealingtemperature片段大小/bpSizeoffragmentsM上引M?F：ATGTCTAACGGTTTTATTCC55678下引M?R：GACTAAATGAAGCACTTTCTM+E2上引E2?F：AAGGGCCAATTCCTCGAGCAC606071下引E2?R：GACTAAATGAAGCACTTTCTN(引物包含載體部分同源臂)上引N?F：GAGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGAT55 551359下引N?R：TGCTCGAGGAATTGGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTC

1.2.2 RNA提取及RT反應 按常規方法采用商品化試劑盒提取變異PEDV的RNA。以提取PEDV的RNA為模板，進行RT反應，反應條件為25 ℃ 10 min；50 ℃ 30 min；85 ℃ 5 s。

1.2.3M基因和N基因PCR擴增 按常規方法，以cDNA為模板，進行 PCR擴增。擴增M基因片段的反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40個循環；72 ℃ 5 min。擴增N基因片段的反應條件為94 ℃ 10 min；94 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，40個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物均通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4M基因克隆至E2載體 參考說明書進行。連接體系如下：M片段2.0 μL，Blunt-E2載體1.0 μL，使用ddH2O補齊體積至5.0 μL，25 ℃連接10 min；連接產物轉化至Trans1-T1感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30 min；42 ℃熱激30 s，立即置于冰上2 min；加入平衡至室溫的LB培養基，250 r·min-1，37 ℃培養1 h；4 000 r·min-1離心1 min，棄部分上清，保留100 μL，輕彈重懸后涂于Amp+抗性平板上，37 ℃培養過夜，構建出pE2-M質粒。

1.2.5E2-M基因PCR擴增 以pE2-M質粒為模板，反應體系與“1.2.3”相同，進行擴增。反應條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min。擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 純化片段 采用回收和純化試劑盒，分別膠回收純化PCR擴增的N片段和PCR擴增的E2-M片段。

1.2.7 無縫拼接 參考pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit無縫拼接試劑盒說明書進行。連接體系如下：2×Assembly Mix 5 μL,純化回收N片段2 μL,純化回收E2-M片段3 μL；于PCR儀中50 ℃連接15 min。

1.2.8 構建pE2-M-N重組質粒 將N基因片段和E2-M基因片段連接產物全部轉化Trans 1-T1感受態細胞中，42 ℃熱激30 s，冰上靜置2 min，加入400 μL LB培養基中，37 ℃ 200 r·min-1搖菌1 h；取搖好的菌液4 000 r·min-1離心1 min后棄部分上清，取菌株吹懸后涂于Amp+抗性的LB平板上，在37 ℃培養箱里培養過夜；18 h后從培養箱中取出平板，隨機挑取轉化至Trans1-T1感受態，菌落PCR鑒定陽性單克隆測序。取活菌經過活化后轉接入LB氨芐抗性培養基，放入搖床37 ℃ 200 r·min-1培養16 h后，收集菌液提取質粒。

1.2.9 原核蛋白表達及鑒定 取pE2-M-N質粒轉化Transetta(DE3)感受態細胞，將克隆菌種分別按照37 ℃(加0.25 μg·mL-1IPTG)、16 ℃(0.25 μg·mL-1IPTG)溫度搖床培養,表達融合蛋白。將菌液12 000 r·min-1離心5 min，將上清移入新的EP管中，沉淀用500 μL的1×PBS重懸，分別取50 μL上清和50 μL沉淀重懸液，加入10 μL 蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min。將蛋白樣品跑10% SDS-PAGE，之后進行考染，鑒定表達蛋白情況。

1.2.10 Western blot驗證目的蛋白 以PEDV的兔抗高免血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP酶為二抗，進行Western blot試驗，采用化學發光成像儀進行檢測。分別以PEDV的M蛋白和N蛋白鼠抗高免血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP酶為二抗，進行Western blot試驗，采用化學發光成像儀進行檢測。

1.2.11 鼠抗M-N融合蛋白抗體的制備及活性檢測 將誘導融合蛋白進行純化，與弗氏完全佐劑充分乳化后，以100 μg·只-1的劑量皮下多點接種6只8周齡小鼠，間隔14 d后，將融合蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化后，以同樣的方式及劑量進行再次免疫。在第二次免疫21 d后，采小鼠血并分離血清。同時設立2只小鼠免疫生理鹽水，作為陰性對照。分別采用純化的PEDV、M蛋白和N蛋白包被的酶標板，采用ELISA方法檢測融合蛋白誘導產生的抗體水平。

2 結 果

2.1 M基因的PCR擴增

以cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約678 bp的基因片段，與預期大小相符，如圖1。

1. M基因片段；M. DL8000相對分子質量標準1. Fragment of M gene; M. DL8000 marker

圖1 M基因擴增結果Fig.1 Colony PCR confirmation of M gene

2.2 N基因的PCR擴增

以cDNA為模板，進行N基因PCR擴增，擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1 359 bp的基因片段，與預期大小相符，如圖2。

2.3 E2-M基因的PCR擴增

以M基因片段連接至pE2載體，連接產物轉化至Trans1-T1感受態細胞中，再以pE2 -M質粒為模板，進行擴增，擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得6 071 bp目的片段，與預期大小相符，如圖2。

1. N基因片段；2、3. E2-M基因片段；M. DL8000相對分子質量標準1. Fragment of N gene； 2, 3. Fragment of E2-M gene；M. DL8000 marker

圖2 E2-M和N基因片段擴增結果Fig.2 Colony PCR confirmation of E2-M and N gene

2.4 M+N基因的PCR鑒定

將N基因和E2-M基因連接產物全部轉化Trans1-T1感受態細胞中，構建出pE2-M-N重組質粒，采用PCR技術進行鑒定，獲得大約為2 037 bp基因片段，與預期大小相符，如圖3。將PCR產物進行序列測定比對分析，表明擴展序列與PEDV-FJFQ2014毒株相應序列的相似性為99.4%。

1～7 . M+N基因片段； M. DL8000 相對分子質量標準1-7. Fragment of M-N gene； M. DL8000 marker

圖3 pE2-M-N重組質粒PCR鑒定電泳圖Fig.3 Colony PCR confirmation of pE2-M-N

2.5 原核蛋白的表達

pE2-M-N重組質粒在0.25 μg·mL-1IPTG的誘導下，轉化Transetta(DE3)感受態細胞中，在37和16 ℃誘導下蛋白均表達，蛋白條帶大小約75 ku，與預期相符，如圖4。誘導目的蛋白在上清和包涵體中均有表達，但主要是在沉淀的包涵體表達量比較多。

1. 未誘導的上清； 2. 37 ℃誘導下的上清； 3. 37 ℃誘導下的沉淀；4. 16 ℃誘導下的上清；5 .16 ℃誘導下的沉淀；M. 蛋白質相對分子質量標準1. Not revulsive supernatant; 2 . Revulsive supernatant at 37 ℃; 3.Revulsive precipitation at 37 ℃ ; 4.Revulsive supernatant at 16 ℃; 5. Revulsive precipitation at 16 ℃; M. Protein marker

圖4 SDS-PAGE電泳圖Fig.4 The SDS-PAGE of protein expressed in Transetta (DE3)

2.6 M-N表達蛋白的純化

采用包涵體洗滌方法對提取蛋白質進行純化后，取蛋白質再次進行SDS-PAGE試驗，結果獲得約75 ku的蛋白片段，如圖5。

1. 誘導后上清；2.誘導后的沉淀；M.蛋白質相對分子質量標準1. Revulsive supernatant；2.Revulsive precipitation；M. Protein marker

圖5 SDS-PAGE檢測蛋白表達結果Fig.5 The SDS-PAGE of protein expressed in Transetta(DE3)

2.7 驗證目的蛋白的表達情況

以兔抗PEDV高免血清為一抗， 通過Western blot試驗表明，獲得約75 ku的目的片段，與預期大小相符，說明表達蛋白能與病毒抗體反應，具有反應原性，如圖6。

1.表達的蛋白； M.蛋白質相對分子質量標準1. Expressed protein； M.Protein marker

圖6 以兔抗PEDV高免血清為一抗用Western blot驗證蛋白表達Fig.6 The Western blot of protein expressed in Transetta (DE3) with hyperimmume serum against PEDV

分別以PEDV的M蛋白和N蛋白鼠抗高免血清為一抗，通過Western blot試驗表明，分別獲得約25和57 ku大小的目的片段，與預期大小相符，說明表達蛋白能與病毒的M蛋白抗體和N蛋白抗體反應，具有反應原性，見圖7。

1.M蛋白高免血清組；2. N蛋白高免疫血清組； M.蛋白質相對分子質量標準1. Hyperimmune serum group of M protein；2. Hyperimmune serum group of N protein; M.Protein marker

圖7 以PEDV M、N蛋白高免血清為一抗用Western blot驗證蛋白表達Fig.7 The Western blot of protein expressed in Transetta (DE3) with hyperimmune sera against M and N protein of PEDV

2.8 鼠抗M-N融合雙基因蛋白抗體的獲得及活性檢測

在M-N融合蛋白二免小鼠21 d后，免疫小鼠血清能與PEDV全病毒、M蛋白和N蛋白發生反應，且相應的效價均在1∶1 000以上，而陰性對照小鼠血清未檢測到相應抗體，表明融合蛋白具有較好的免疫活性，見圖8。

圖8 抗體產生情況Fig.8 The situation of generated antibody

3 討 論

PEDV屬于尼多病毒目、冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，病毒核酸為正義單鏈RNA，PEDV基因組全長約為28 kb[17]，主要結構蛋白為纖突糖蛋白(S蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和小膜蛋白(E蛋白)[18-19]。PEDV的M基因編碼整合膜蛋白，是一種穿膜糖蛋白，從N端到C端有3個糖基化位點，通過其C末端與核衣殼結合可使核衣殼和病毒包膜聯系在一起[20]，從而決定和影響了病毒的出芽。另外，M蛋白能介導機體產生α干擾素，可作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原，并已成為開展PEDV血清學診斷抗原的主要蛋白之一。N蛋白與基因組RNA結合, 形成螺旋狀的核蛋白體, 參與病毒基因組轉錄、RNA 的包裝、病毒組裝，也是病毒主要的免疫原蛋白之一，可誘發機體產生有效的免疫應答[21]。另外，由于N蛋白具有抗原性，在PEDV感染早期就能在豬體內產生較高水平的抗體并誘導病豬體內進行細胞免疫反應[22]。基于M和N基因為病毒的重要功能基因，在體外通過生物技術把M與N基因進行雙基因融合，并表達出相應的融合蛋白，對今后開展該病的診斷技術和免疫機制研究，具有重要的現實意義和應用前景。

本文選用pE2哺乳動物原核表達載體，該載體為平末端線性載體，載體兩端偶聯有拓撲異構酶，此酶具有限制性內切酶和連接酶的功能，因此在構建載體時，只需將載體和特異性片段在25 ℃孵育5～10 min便可快速平端克隆技術克隆PCR產物，通過增強型CMV啟動子高效表達目的基因，轉化到感受態細胞中進行克隆。另外，在基因連接方面，采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit無縫拼接試劑盒，利用試劑盒特殊的重組酶和同源重組的原理，將E2-M線性化后的載體末端片段基因與擴增N基因片段的上游引物中重疊區域的片段進行定向重組，成功實現了M與N基因的高效無縫拼接，這種連接方式僅需要15 min的反應時間，無需對片段進行酶切，不受酶切位點的影響，也不需要額外引進其他基因序列，連接效果可通過PCR和測序方法進行鑒定。本研究將建立的pE2-M-N重組質粒進行了序列測定分析，獲得準確的基因片段。

在雙基因原核表達方面，樂敏等[23]利用原核表達載體 pGEX-KG構建出豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF7和ORF5雙基因質粒，并表達出了具有免疫原性的雙基因蛋白。本文則根據變異PEDV的M和N基因，通過pE2原核表達載體，構建出變異PEDV的M和N雙基因融合質粒，并表達出了M-N融合雙基因蛋白，通過Western blot技術和應用于免疫小鼠也進一步驗證了表達蛋白具有免疫活性，這為今后開展變異PEDV的免疫診斷技術和免疫學研究奠定了理論基礎和技術支撐。

4 結 論

構建變異PEDV的pE2-M-N融合雙基因質粒，并表達了具有免疫原性M-N融合蛋白。為進一步開展變異PEDV的診斷技術和免疫學等研究，奠定良好基礎。

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