伊犁馬ACTN3基因外顯子多態性研究

王建文，李林玲，王鏡力，孟 軍，曾亞琦，姚新奎*，辛雅莉(.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052； 2.新疆農業大學馬產業研究院，烏魯木齊 830052)

輔肌動蛋白(ACTN)是近年來在細胞骨架與細胞運動研究中的熱點蛋白。目前的研究結果表明，在哺乳動物中主要存在4種不同類型的輔肌動蛋白，其中輔肌動蛋白-2(ACTN2)和輔肌動蛋白-3(ACTN3)為骨骼肌Z線的主要組成部分，且這兩種蛋白具有高度的相似性(81%序列一致)[1-3]。ACTN3基因僅在骨骼肌快肌纖維中表達，且其多態性與肌肉力量有關，可能依賴于其對纖維類型比例的控制功能，與纖維分布和肌肉力量有顯著關聯，在ACTN3基因敲除小鼠中三羧酸循環、線粒體電子信號傳遞鏈和脂肪酸氧化代謝途徑中的關鍵酶一直較高[4-5]。與此同時，ACTN3蛋白缺乏對骨骼肌結構[6]、新陳代謝[7]及鈣通路[8]等均會產生一定的影響。Gu等[9]通過對純血馬進行研究，結果顯示，ACTN3基因在純血馬中有4個突變位點。Mata等[10]通過對法國騎乘馬的研究表明，ACTN3基因的cDNA有8個突變位點，其中6個 外顯子突變位點均為同義突變。Thomas等[11]的研究結果表明，5個 澳大利亞品種馬中共發現34個突變位點，其中啟動子g.1104G>A突變后，純血馬中未發現AA基因型，重挽型品種(夏爾馬和克萊茲代爾馬)中未發現GG基因型，其中純血馬為優秀的速度型運動馬，而夏爾馬和克萊茲代爾馬則為挽用型，趙啟南等[12]通過對蒙古馬進行調教訓練的研究也顯示，ACTN3基因的表達上調，這些研究在一定程度上顯示，ACTN3基因可能會對運動性能具有重要的意義。

伊犁馬是我國知名運動馬品種，其以哈薩克馬為母本，通過與奧爾洛夫馬、頓河馬、阿哈捷金馬等輕型馬品種進行雜交培育而成，并與純血馬、新吉爾吉斯馬等品種進行雜交改良[13]，現為我國優良的國產騎乘馬品種[14]，具有良好的運動性能。現對伊犁馬運動性能的研究主要集中在調教訓練、血液生化等方面，對分子標記研究相對較少。因此，針對ACTN3基因的結構與功能，并將其運用于實際生產具有重大意義。

本研究以伊犁馬為試驗動物，通過測序法對ACTN3基因多態性位點進行篩選，并進行連鎖不平衡及生物信息學分析，探究伊犁馬ACTN3基因多態性，為伊犁馬的早期運動選材及分子選育等提供相關理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以38匹健康伊犁馬為研究對象，其中公馬16匹，母馬22匹，均為2016年伊犁馬常態化賽事參賽馬匹。通過枸櫞酸鈉采血管采集靜脈血樣5 mL，混勻后，置于-20℃保存。

1.2 引物設計與PCR擴增

通過DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取血液DNA。根據NCBI公布的純血馬ACTN3序列(HQ005425)采用Primer-BLAST對所有外顯子進行引物設計，當相鄰兩個外顯子之間間隔較小(小于350 bp)時，兩個外顯子通過同一對引物進行擴增(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。通過降落PCR進行擴增，PCR體系(25 μL)：上下游引物各0.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq酶(5 U·μL-1)0.2 μL，ddH2O加至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火45 s，共計10個循環，每個循環降低0.5 ℃，72 ℃延伸1 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環，72 ℃修復延伸10 min。PCR擴增產物用1.5%TAE瓊脂糖電泳進行檢測。

1.3 擴增產物測序和BLAST分析

將所有擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并利用DNAStar軟件對所測得結果進行校正，與馬ACTN3基因序列進行對比(HQ005425)，通過BLAST分析并確定突變位點。

1.4 伊犁馬群體遺傳結構分析

通過haploview 4.2軟件根據測序情況計算雜合度、有效等位基因數、多態信息含量、基因(型)頻率及檢測Hardy-Weinberg平衡狀態(當P>0.05時判定處于Hardy-Weinberg平衡狀態)。

1.5 連鎖不平衡及單倍型分析

通過HaploView 4.2軟件對所測外顯子區域突變位點進行連鎖不平衡分析及單倍型構建。

1.6 生物信息學分析

利用 NCBI 中的 ORF find確定尋找馬ACTN3基因的編碼區，并進行氨基酸的翻譯，利用BioXM 2.6對突變位點編碼的氨基酸序列進行比對，通過在線軟件RNAfold預測不同單倍體mRNA二級結構(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)及最小自由能，運用在線軟件sopm預測蛋白質二級結構(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)。

表1擴增引物信息

Table1PCRprimerinformation

上游引物序列(5′→3′)Forwardprimersequence下游引物序列(5′→3′)Reverseprimersequence片段長度/bpLength所擴增外顯子AmplifiedexonTTCCAGTGCCCCCAGATTCTCAGAGGACGGATGGGCAGA4971CCTCATCCAAACTGGGACCTGTGGTCCCTACACTCCCTCCTG7322、3CTGAACCCGTGAAGCTGGACTGTTCAACATTGACTCAGTCCTCCTA6254、5TGGCGCAAGTCTGGTAATGAAGAAGGATTCTGACCAGGGAGTG5276、7AGTGGCTGTGACTAAATGTCTCTGGGGTGAAGATGGCAGGAGAAG7538、9TACTGGTCCCTGGACTCAGAAATCATCACGGTTCACCCATTGTA53710TCCAGCTCTGCCGATGTTCCAGACACTGTGGCCCAAAGACG42711AGGGTAGACTGGGCAGGTGTGGAGACAGGGTTACGGGAGGAG47912CCTATCTACCCTGGCTGTCTCATTCCCGTCCCCATTCCTCAG56113、14AGTGCTGGGCTGGGAGACAGCAGACTCCAGATCCGAAGGT45115AGGTTGAATAACTTGCCCAGGAGTCACTTCCACTTGCTAGGTCTC70116、17ATCATCAAACTTTAAGGCAGGGAGGCGTGATGAGGAGGAAGTG59518、19GACGGTCTATGGAGAAAGGAAGTAAGCACTTGGCTGGTCATTCT65020、21

2 結 果

2.1 伊犁馬ACTN3基因測序及SNP鑒定

所測序列與馬ACTN3基因序列(HQ005425)具有高度同源性，可以確定PCR產物為馬ACTN3的基因序列。通過對測序結果進行比對分析，結果顯示，在本試驗中ACTN3基因共發現有8個外顯子突變位點，各突變位點的具體信息如表2所示。其中位于第15外顯子的T9059G突變為錯義突變，突變使得ACTN3蛋白質的第594個氨基酸由甘氨酸變為半胱氨酸，其余各突變位點均為同義突變。

表2ACTN3基因外顯子突變位點信息

Table2TheinformationofSNPsofACTN3geneexon

位點Site分布DistributionEquCab2．0位置EquCab2．0position參考位置ReferencepositionSNP突變類型Substitutiontype氨基酸位置AminoacidpositionSNP1外顯子4265165343334G/A同義突變129SNP2外顯子10265194066206A/G同義突變366SNP3外顯子14265218088608A/G同義突變534SNP4外顯子15265222599059T/G錯義突變594SNP5外顯子15265222919091C/G同義突變604SNP6外顯子192652386010660C/T同義突變778SNP7外顯子202652450411304C/T同義突變814SNP8外顯子212652471711517A/G同義突變858

2.2 伊犁馬ACTN3突變位點的遺傳學分析

對檢測出的突變位點的基因(型)頻率及多態信息含量等參數進行計算，如表3所示。在伊犁馬中G3334A、A8608G、T9059G、C9091G和C11304T 5個 突變位點均只檢測到兩種基因型，其余3個突變位點檢測到3種基因型。G3334A、A6206G和A11517G的優勢等位基因為G，G3334A的優勢基因型為GG，A6206G和A11517G的優勢基因型為AG。A8608G的優勢等位基因為A，優勢基因型為AA。T9059G的優勢等位基因為T，優勢基因型為TT。C9091G、C10660T和 C11304T的優勢等位基因為C，優勢基因型為CC。根據多態信息含量(PIC)的分類，A6206G和 A11517G屬于中度多態(0.250.05)。

表3伊犁馬ACTN3突變位點分析

Table3SNPsanalysisofACTN3inYilihorse

位點Site基因型頻率/%Genotypefrequency等位基因頻率/%Allelefrequency雜合度He有效等位基因數Ne多態信息含量PICH?EP值PvalueG3334AGGAGAAGA72．97(27)27．03(10)0．00(0)86．4913．510．23371．30510．20640．9930A6206GAAAGGGAG7．89(3)52．64(20)39．47(15)34．2165．790．45011．81860．34880．5514A8608GAAAGGGAG97．37(37)2．63(1)0．00(0)98．681．320．02601．02670．02561．0000T9059GTTTGGGTG94．74(36)5．26(2)0．00(0)97．372．630．05121．05400．04991．0000C9091GCCCGGGCG97．37(37)2．63(1)0．00(0)98．681．320．02601．02670．02561．0000C10660TCCCTTTCT86．84(33)10．53(4)2．63(1)92．117．890．14541．17010．13490．3836C11304TCCCTTTCT76．32(29)23．68(9)0．00(0)88．1611．840．20881．26390．18701．0000A11517GAAAGGGAG15．79(6)63．16(24)21．05(8)47．3752．630．49861．99440．37430．2128

2.3 伊犁馬ACTN3各位點連鎖不平衡分析與單倍型構建

通過haploview 4.2軟件構建伊犁馬ACTN3外顯子的連鎖不平衡圖譜，并進行連鎖不平衡分析，如圖1和表4所示。在各突變位點中存在不同程度的連鎖，其中A6206G和A11517G間存在強的連鎖不平衡(D’>0.75， r2>0.33)，其余各突變位點間連鎖關系相對較弱。通過haploview 4.2軟件對各突變位點進行單倍型構建，結果如表5所示，在伊犁馬ACTN3基因外顯子中共構建14個單倍型，各單倍型頻率為0.012～0.477，其中優勢單倍型為H1(GGATCCCG)。

2.4 伊犁馬ACTN3 mRNA和蛋白的生物信息學分析

通過RNAfold對所構建14種單倍型的mRNA二級結構進行分析，如圖2所示。在所構建的單倍型中，各二級結構間存在一定程度的改變，且其最小自由能也存在一定的差異，最小自由能為-4 719.22 ～-4 694.56 kJ·mol-1，其中單倍型H9(GAAGCCCA)的二級結構最小自由能最大，單倍型H13(GGGTCCTA)的二級結構最小自由能最小。

圖1 ACTN3各位點連鎖不平衡分析Fig.1 Linkage disequilibrium analysis of ACTN3 SNPs

表4ACTN3基因多態位點配對連鎖不平衡分析

Table4AnalysisofpairwiselinkagedisequilibriumofACTN3geneSNPs

位點SiteG3334AA6206GA8608GT9059GC9091GC10660TC11304TA11517GG3334A0．4481．0000．3231．0000．1811．0000．332A6206G0．0161．0001．0001．0001．0001．0000．909A8608G0．0020．0261．0001．0001．0001．0001．000T9059G0．0190．0520．0001．0000．4141．0001．000C9091G0．0020．0260．0000．0001．0001．0001．000C10660T0．0180．0450．0010．0540．1561．0001．000C11304T0．0220．2580．0990．0040．0020．0121．000A11517G0．0190．4770．0150．0300．0150．0950．149

對角線右上方為D’，左下方為r2

D’ data are above the diagonal for SNPs, r2data are below the diagonal for SNPs

表5ACTN3基因單倍型頻率分析

Table5HaplotypefrequenciesofACTN3gene

項目Item單倍型HaplotypeH1H2H3H4H5H6H7序列SequenceGGATCCCGGAATCCCAGAATCCTAGGATCTCAAGATCCCAAGATCCCGAAATCCCA頻率Frequency0．4770．1890．0920．0390．0380．0360．034H8H9H10H11H12H13H14序列SequenceGGATCCCAGAAGCCCAAGATCTCAGAATCCTGGGATGTCAGGGTCCTAAGAGCTCA頻率Frequency0．0150．0140．0140．0140．0130．0130．012

通過sopm對不同基因型所編碼ACTN3蛋白質的二級結構進行預測，結果如表6所示。結果表明，T9059G為錯義突變，由于氨基酸的變化使得ACTN3蛋白質的二級結構發生了改變。β折疊由5.65%變為5.88%；α螺旋由64.63%變為64.19%；無規卷曲度由19.29%變為19.40%；伸展度由10.42%變為10.53%。

3 討 論

ACTN3蛋白的主要功能之一是維持細胞骨架結構[15-16]，在人基因中定位于11q13.1染色體，小鼠基因中定位于194.12 cM，且對人和小鼠的相關研究結果表明其對運動性能有著顯著影響[17-21]。ACTN蛋白最重要的作用是結合肌動蛋白并使其鏈接成束[16]，維持不同細胞特定的形態，并賦予細胞一定的韌性與強度。同時還能結合如胞質蛋白、膜受體和信號分子等蛋白分子，參與細胞活動，對肌動蛋白絲的形成與定位具有重要作用。Ebashi等[22]首次從兔肉中提取出α-輔肌動蛋白，并認定其為肌動蛋白和肌球蛋白體外結合的必需蛋白。

在ACTN3外顯子中共鑒定出8個突變位點，其中3個突變位點與前人的研究結果一致[10-11]，新發現5個多態位點(G3334A、A8608G、T9059G、C9091G和C10660T)。8個多態位點所對應編碼的氨基酸分別處于ABD域、中心桿狀域(RLs域)和“EF”手型域，ABD域的主要生理作用是維持Z線完整性及肌纖維組織[23]，能與其它Z線蛋白[24]和磷脂、磷脂酰肌醇二磷酸[25-26]相交聯。RLs域由4個血影蛋白組成[27]，其二級結構顯示為3個α螺旋[28]，主要通過與K相關蛋白質相互作用影響糖酵解酶活性[29]，“EF”手型域結合Ca2+，對肌動蛋白[30]及其它蛋白的動力學進行調節，從而影響肌纖維類型[31]。這表明，以上突變位點可能會影響到馬ACTN3蛋白質結構與功能，影響肌纖維結構、信號傳導及氧化代謝等，從而影響馬匹的運動性能。

多數情況下，基因對性能的影響是多個突變共同作用的結果[32]。本研究通過對所檢測到的8個多態位點進行連鎖不平衡分析表明，各突變之間存在一定程度的連鎖，并構建出14種單倍型。通過對不同單倍型mRNA進行二級結構分析顯示，各單倍型間二級結構與最小自由能有一定的差異，其中單倍型H9(GAAGCCCA)的最小自由能最高，這表明單倍型H9(GAAGCCCA)的二級結構穩定性最低，而單倍型H13(GGGTCCTA)的最小自由能最低，因此其mRNA的二級結構最為穩定。

圖2 ACTN3不同單倍型mRNA二級結構圖Fig.2 mRNA secondary structure of different haplotypes of ACTN3

表6突變前后ACTN3蛋白質二級結構分析

Table6PredictionofACTN3proteinsecondarystructurebeforeandaftermutation

%

通過進一步對各突變導致的蛋白質二級結構進行分析，結果顯示，所檢測到的8個多態位點中有7個 為同義突變，其氨基酸并未發生改變，其蛋白質結構與功能是否發生改變及其對運動性能的影響還有待于進一步的研究明確。而T9059G為錯義突變，通過在線軟件進行預測分析，結果顯示，其mRNA最小自由能增大，穩定性降低，在蛋白質翻譯過程中會導致第594號氨基酸由甘氨酸變為半胱氨酸，對二級結構的預測分析結果顯示，其二級結構發生改變，這有可能會導致蛋白質三級結構改變，從而影響到氧化酶活性，使得馬匹的運動性能受到影響。

4 結 論

在伊犁馬ACTN3基因中共發現8個多態位點，共可組成14種單倍型，其中單倍型H1(GGATCCCG)為優勢單倍型，不同單倍型mRNA的二級結構與最小自由能有一定的差異。在8個突變位點中， T9059G為錯義突變，使得編碼ACTN3蛋白質的二級結構發生改變，可能對馬ACTN3蛋白質功能產生影響，從而影響馬匹的運動性能，該突變位點可能是與馬匹運動性能相關的重要功能位點。

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