豬圓環(huán)病毒3型TaqMan 熒光定量PCR方法的建立和初步應(yīng)用

李 暢，庫(kù)旭鋼，王俊偉，李 靜，朱 玲，何啟蓋*(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種單股環(huán)狀負(fù)鏈的DNA病毒，為圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員，包括圓環(huán)病毒1型(PCV1)和圓環(huán)病毒2型(PCV2)兩種基因型[1]。PCV1是一種豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)污染物，無(wú)致病性[2]。PCV2在20世紀(jì)90年代首次發(fā)現(xiàn)于加拿大的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)病豬中，被認(rèn)為是圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的主要病原，主要導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、繁殖障礙等，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

2016年以來(lái)，多篇報(bào)道稱通過(guò)宏基因組等技術(shù)從皮炎腎病綜合征和繁殖障礙豬的病料以及口腔液中鑒定出一種新型豬圓環(huán)病毒，即豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[4-7]。根據(jù)已有的報(bào)道，PCV3在美國(guó)、中國(guó)和韓國(guó)呈流行趨勢(shì)，且可能存在跨國(guó)傳播情況[5,7-8]。

鑒于PCV2和PCV3感染能導(dǎo)致相似的臨床癥狀，因此，十分有必要建立一種快速、高效、敏感、特異的檢測(cè)方法來(lái)區(qū)分PCV3和其他病毒感染。熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、簡(jiǎn)便、高效、特異、穩(wěn)定等特點(diǎn)在目前的病原檢測(cè)工作中被廣為應(yīng)用[9]。

本研究主要目的在于建立一種快速、高效、特異檢測(cè)PCV3的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并用該方法對(duì)湖北地區(qū)病料進(jìn)行PCV3檢測(cè)，評(píng)估PCV3在該地區(qū)的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品，毒株和菌株 臨床檢測(cè)樣品為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心門診臨床病死豬的DNA樣品。豬圓環(huán)病毒2b亞型(porcine circovirus type 2b，PCV2b)、豬圓環(huán)病毒2d亞型(porcine circovirus type 2d，PCV2d)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)，豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)、豬支氣管敗血波氏桿菌(Brodetellabronchiseptica，Bb)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 Viral-DNA Kit(病毒DNA提取試劑盒，D3892)購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；TIANamp Genomic DNA Kit(血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，DP304)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(質(zhì)粒小提試劑盒，EM101)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Biomiga Gel/PCR Extraction Kit(膠/PCR產(chǎn)物回收試劑盒，DC3511)購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司；HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；iTaqTMUniversal Probes Supermix(172-5134)、384孔PCR反應(yīng)板、96孔PCR反應(yīng)板以及S1000TMThermal Cycler(PCR儀)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司、ViiATM7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI上已公布的PCV3基因組序列(登錄號(hào):MF079254、 MF079253、KY996345、KY996340、KY996338、KY778777、KY075994、KY075988、KX966193、KX898030、KX778720等)以及相應(yīng)的Cap基因序列，設(shè)計(jì)引物(表1)，以PCV3陽(yáng)性樣品DNA為模板，擴(kuò)增得到Cap基因片段(645 bp)，將該片段連接到pMDTM18-T Vector載體上，篩選陽(yáng)性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)相應(yīng)菌液，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并使用Nano drop測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，并稀釋成1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1。

1.1.4 定量引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 下載GenBank中已公布的PCV3序列，比較其與PCV1、PCV2的相似性，并根據(jù)其保守區(qū)域使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物(表2)，使用SYBR熒光定量PCR驗(yàn)證其能否有效地檢測(cè)該片段。根據(jù)SYBR熒光定量PCR結(jié)果，選定引物對(duì)F2/R2和F3/R3擴(kuò)增序列的交集區(qū)域，設(shè)計(jì)一條TaqMan探針(表2)。引物和探針均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1本研究中使用的PCV3ORF2基因的引物

Table1TheprimersforPCV3ORF2geneinthisstudy

引物或探針Primer/Probe序列Sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductsize熔解溫度/℃MeltingtemperaturePCV3?F15′?CGGGATCCATGAGACACAGAGCTATATTC?3′64555．9PCV3?R15′?GGAATTCTTAGAGAACGGACTTGTAACGA?3′55．2

表2本研究中所使用的定量引物和探針

Table2SequenceofqPCRprimersandTaqManprobeinthisstudy

引物或探針Primer/Probe序列Sequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductsize熔解溫度/℃MeltingtemperaturePCV3?F15′?CGGACTTGTAACGAATCCAAACT?3′7855．9PCV3?R15′?GGAGCATTTATGTCCCGGAAA?3′55．2PCV3?F25′?TATTCATTAGGAGGCCCACA?3′14252．6PCV3?R25′?GCAGTTTCCCATTCGTTTAG?3′52．1PCV3?F35′?GGAGACGACGACGCCACAG?3′14460．3PCV3?R35′?CGTGCCAGGGCTTGTTATTC?3′56．7PCV3?F45′?GCGGAAAGTTCCACTCGTAA?3′11455．3PCV3?R45′?GAAGAGGCTTTGTCCTGGGT?3′56．6PCV3?Probe5′?FAM?ACTCCACCATGAACGTCATTTCC?TAMRA?3′57．7

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 以1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，以FI/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4為引物，按照說(shuō)明書使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)鑒定四對(duì)引物能否有效地檢測(cè)PCV3。再按照SYBR定量PCR的結(jié)果，根據(jù)F2/R2和F3/R3引物對(duì)所擴(kuò)增區(qū)域的公共序列部分，設(shè)計(jì)TaqMan探針。再以1.29×105拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，在10 μL的PCR反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1的引物F2/R2和終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1的Probe，按照說(shuō)明書使用iTaqTMUniversal Probes Supermix，根據(jù)結(jié)果選定最佳的引物濃度和探針濃度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 按照說(shuō)明書使用iTaqTMUniversal Probes Supermix，加入最佳濃度的引物和探針，以1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。將所得結(jié)果中的Ct值為Y軸、1.29 × lg(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，拷貝·μL-1)為X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 敏感性和特異性試驗(yàn) 以1.29×100～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用本研究所構(gòu)建的熒光定量PCR和本實(shí)驗(yàn)室所使用的常規(guī)PCR[4]進(jìn)行檢測(cè)，確定兩種方法的敏感性并作比較；以陽(yáng)性PCV2b、PCV2d、PEDV、PRRSV、PoRV、HPS、App、Bb、Pm DNA或者cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR以確定該方法的特異性。

1.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別以1.29×102、1.29×105、1.29×108拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進(jìn)行3次批內(nèi)和批間熒光定量PCR，根據(jù)結(jié)果中的Ct值計(jì)算批次內(nèi)變異系數(shù)和批次間變異系數(shù)，并以此判定該方法的重復(fù)性。

1.2.5 臨床樣品的檢測(cè) 應(yīng)用本研究建立的TaqMan熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法檢測(cè)2016—2017年間湖北省及周邊地區(qū)所收集的124份DNA樣品，將Ct值小于30的樣品判定為陽(yáng)性，同時(shí)使用本實(shí)驗(yàn)室建立的PCV2熒光定量PCR方法檢測(cè)樣品中的PCV2[10]，以此評(píng)估PCV3和PCV2在該地區(qū)的流行情況。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR引物和探針的選定

以1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別以FI/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4為引物，按照說(shuō)明書使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)鑒定四對(duì)引物能否有效地檢測(cè)PCV3，得到4條標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖略)，均呈良好的線性關(guān)系，證明四對(duì)引物均能有效檢測(cè)PCV3。因?yàn)镕2/R2和F3/R3所擴(kuò)增產(chǎn)物的序列具有交叉區(qū)域，故根據(jù)此交叉區(qū)域設(shè)計(jì)探針。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

以提高擴(kuò)增效率和敏感度為標(biāo)準(zhǔn)，以1.29×105拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，對(duì)F2/R2引物濃度和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)體系(10 μL)：2× iTaqTMUniversal Probes Supermix 5 μL，F(xiàn)2/R2(10 μmol·L-1)各0.5 μL，TaqMan Probe(5 μmol·L-1)0.5 μL，待檢模板(100 ng最優(yōu))2 μL，補(bǔ)加Nuclease-free water至10 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

利用優(yōu)化后的定量PCR反應(yīng)對(duì)1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量，以Ct值為Y軸，1.29 × lg(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，拷貝·μL-1)為X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=-3.258X+36.721，相關(guān)系數(shù)R2為0.996(圖1)，擴(kuò)增效率為100.72%，說(shuō)明Ct值與模板量之間呈良好的線性關(guān)系。本方法判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值低于30，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品為陽(yáng)性；Ct值大于32或無(wú)有效Ct值的樣品為陰性。

圖1 PCV3 TaqMan探針熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of PCV3 ORF3 genes by TaqMan probe real-time PCR

2.4 敏感性和特異性試驗(yàn)

以1.29×101～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別使用本研究所建立的熒光定量PCR方法和普通PCR方法擴(kuò)增，檢驗(yàn)定量PCR和常規(guī)PCR的敏感性并做對(duì)比，結(jié)果顯示定量PCR方法的最低檢出量為1.29×102拷貝·μL-1(圖2A)，而常規(guī)PCR在1.29×104拷貝·μL-1時(shí)僅能從凝膠電泳圖上看到微弱的目的條帶(圖2B)，表明本研究所建立的定量PCR方法敏感性是常規(guī)PCR的1 000倍左右。

用建立的PCV3熒光定量PCR方法檢測(cè)PCV2b、PCV2d、PEDV、PRRSV、PoRV、Hps， App、Bb、Pm DNA或者cDNA樣品，均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增現(xiàn)象，表明該方法特異性良好(圖3)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

選取1.29×102、1.29×105、1.29×108拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用本研究所建立的熒光定量PCR分別進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)和3個(gè)批間檢測(cè)，各個(gè)濃度的Ct值、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)見(jiàn)表3，該方法批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)變異系數(shù)均小于1.5%，說(shuō)明本研究所建立的熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品的檢測(cè)

結(jié)果顯示，常規(guī)PCR檢測(cè)出樣品中PCV3陽(yáng)性率為1.62% (2/124)，本研究所建立定量方法的陽(yáng)性率為8.06% (10/124)，這與袁萬(wàn)哲研究團(tuán)隊(duì)使用TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)的PCV3陽(yáng)性率12.5%(14/112)基本一致[11]，但是顯著低于馬靜云研究團(tuán)隊(duì)使用SYBR熒光定量PCR檢測(cè)的PCV3陽(yáng)性率86.70% (176/203)[12]，這可能與樣品來(lái)源有關(guān)，本研究中所用樣品來(lái)自科前生物股份有限公司，而其他方法檢測(cè)的樣品主要源于具有典型病癥的豬。檢測(cè)陽(yáng)性樣品和PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均呈現(xiàn)正常的“S”形擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線。樣品中PCV2的陽(yáng)性率為72.78% (90/124)，PCV2和PCV3共感染率為8.06% (10/124)。

A.熒光定量PCR方法結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度1.29×109～1.29×101拷貝·μL-1)；B.普通PCR方法結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度1.29×107～1.29×100拷貝·μL-1)；M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P. 陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照A. Result of real-time qPCR (standard plasmid concentration: 1.29×109 - 1.29×101 copies·μL-1); B. Result of common PCR (standard plasmid concentration: 1.29×107 - 1.29×100 copies·μL-1); M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control

圖2 敏感性試驗(yàn)Fig.2 Sensitivity test

PCV3樣品為陽(yáng)性；PCV2b、PCV2d、PEDV、PRRSV、PoRV、Hps、App、Bb、Pm DNA或者cDNA樣品均為陰性PCV3 samples were positive; PCV2b, PCV2d, PEDV, PRRSV, PoRV, Hps, App, Bb, Pm DNA or cDNA samples were negative

圖3 特異性檢驗(yàn)Fig.3 The specificity test

3 討 論

2016年以來(lái)，中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、波蘭等多個(gè)國(guó)家均報(bào)道稱通過(guò)宏基因組等技術(shù)發(fā)現(xiàn)PCV3，其在各國(guó)的流行情況呈上升趨勢(shì)，并且各國(guó)之間PCV3的同源性和序列相似性很高，提示PCV3可能存在跨國(guó)傳播情況[5-8]。PCV3感染能導(dǎo)致和PCV2感染相似的臨床癥狀，并且在PDNS(皮炎腎炎綜合征)豬的心、腎、肺、淋巴結(jié)組織以及皮膚組織等處均能檢測(cè)到病毒核酸的存在[4-5]。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的常規(guī)PCR方法[8]，靈敏度亟待提高，因此有必要建立一種敏感性更高的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)PCV3。

表3熒光定量PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)檢測(cè)結(jié)果

Table3Theintra-andinter-assayCVsforCtvaluesresultofreal-timeqPCR

重復(fù)性試驗(yàn)Reproducibilitytest標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度/(拷貝·μL-1)StandardplasmidconcentrationCt值(x±s)Ctvalue(x±s)變異系數(shù)(CV)/%Coefficientofvariation批內(nèi)重復(fù)1．29×10230．97±0．210．69Intra?assay1．29×10521．04±0．231．081．29×10810．33±0．121．16批間重復(fù)1．29×10230．30±0．351．16Inter?assay1．29×10520．41±0．301．471．29×10810．62±0．161．47

熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、高效、特異和穩(wěn)定等特點(diǎn)在目前的病原檢測(cè)工作中被廣為應(yīng)用[9]。目前最常用的熒光定量方法主要分為兩種，SYBR染料為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法和TaqMan探針為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法。相比于染料法熒光定量PCR方法，TaqMan探針定量PCR技術(shù)擁有更高的敏感性[13-14]，故本研究中采用兩種定量方法相結(jié)合的方式，先采用染料法對(duì)初設(shè)計(jì)的多對(duì)定量引物進(jìn)行初步篩選，再根據(jù)篩選結(jié)果，設(shè)計(jì)TaqMan探針，建立TaqMan探針定量PCR檢測(cè)方法雛形并逐步優(yōu)化完善。本研究中引物和探針的設(shè)計(jì)基于NCBI中已公布的所有PCV3全基因序列以及相應(yīng)的PCV3Cap基因序列，并且將所設(shè)計(jì)引物和探針與Sus scrofa Refseq mRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，PCV1、不同基因型PCV2、PEDV等多種豬病原體基因序列進(jìn)行比對(duì)，確保本研究定量方法的特異性。本研究所建立的TaqMan熒光定量PCR最低檢出限量為1.29×102拷貝·μL-1，明顯高于本實(shí)驗(yàn)室之前使用的常規(guī)PCR方法[8]，與袁萬(wàn)哲研究團(tuán)隊(duì)建立TaqMan熒光定量PCR(1.02 × 102拷貝·μL-1)[11]和馬靜云研究團(tuán)隊(duì)建立的SYBR熒光定量PCR[12]靈敏性(1.73×102拷貝·μL-1)相近，均能特異性地檢測(cè)PCV3，且穩(wěn)定性更高。

利用本研究所建立的TaqMan熒光定量PCR方法檢測(cè)2016-2017年間湖北省及其周邊地區(qū)豬場(chǎng)的病豬，核酸樣品中PCV3單獨(dú)存在情況和PCV2/PCV3共存在情況，PCV3的單獨(dú)感染率為8.06% (10/124)，PCV2/3共感染率為8.06% (10/124)；在之前的研究中PCV2/PCV3共感染分別是12.5%(14/112)[11]和15.8%(35/222)[8]。以上研究均證明PCV2感染和PCV3的感染之間存在密切的聯(lián)系，兩者之間的共感染機(jī)制研究仍有待深入研究。臨床中的PCV3感染情況需要持續(xù)監(jiān)測(cè)，PCV3的病毒分離以及PCV3與PCV2的共感染機(jī)制需要更多的關(guān)注。

4 結(jié) 論

成功建立PCV3 TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法，能夠靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)臨床樣品中PCV3的存在情況，為PCV3的監(jiān)測(cè)和防控提供了有力的手段。

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