His-CDs@NaTbF4的合成及其在組氨酸檢測和腫瘤細胞成像中的應用

劉 玲 李瑞怡 來 婷 李在均 顧志國

（江南大學化學與材料工程學院，無錫 214122）

0 引 言

碳點（carbon dots，CDs）是尺寸小于 100 nm 的碳納米材料，包括石墨烯量子點等。碳點具有比表面積大、載流子遷移率高、柔性、熱穩定好和化學惰性等特點[1]。相對于有機熒光染料、貴金屬納米簇、熒光蛋白和半導體量子點，碳點具有更高的發光效率、生物相容性和抗漂白能力[2]。目前，碳點已應用于生物傳感、細胞成像、藥物傳輸、光電子器件等領域[3-6]。提高碳點光學性能的主要方法是異原子摻雜和功能化。摻雜是指在骨架碳結構中引入其他原子。雜原子可改變碳點的電子分布和帶隙間距，實現對光電性能的有效調節[7]。Lu小組通過熱解鄰苯二胺和多巴胺的混合物得到一種能近紅外熒光發射的氮摻雜碳點[8]。功能化是在碳片邊緣引入特定化學活性基團或結構單元[9]。Hola小組以沒食子酸衍生物為前驅體水熱合成了烷基鏈功能化碳點[10]。研究發現，通過改變烷基種類可實現對碳點親水性和疏水性的有效調節，呈現出羧基誘導下的熒光紅移現象。

稀土氟化物具有寬帶隙、低聲子能量、高熱的特性和環境穩定性，是一種重要的發光材料[11]。稀土氟化物的發光性能取決于它的組成，不同的發光稀土和基質稀土組合將產生不同顏色的熒光發射[12]。例如，NaTbF4和NaEuF4因稀土電子躍遷能級不同分別發出明亮的綠光和紅光。此外，晶型、粒徑及表面修飾也不同程度地影響稀土氟化物的發光性能。為此，人們開發出許多稀土氟化物合成方法。其中，以溶劑熱法和水熱法最為常用[13-14]。溶劑熱法通常采用油酸、十八烯等有機溶劑為介質制備稀土氟化物晶體。溶劑熱法制備的稀土氟化物尺寸較小且均一，更適合細胞和生物體內的光學檢測與成像，但合成條件苛刻，所制備的氟化物因水溶性差需要改性后方可使用。相對于溶劑熱法，水熱法具有操作簡單和產品結晶度好的特點。Luo小組研究水熱合成六方相NaTbF4，發現Eu3+摻雜能調節NaTbF4的熒光發射。Eu3+摻雜量增加到1%時NaTbF4的熒光由綠色轉化為紅色[15]。然而，傳統水熱法制備的稀土氟化物粒徑偏大，極大地限制了它們在生物分析等領域的應用。

碳點和稀土氟化物是各具特色的發光材料，它們的結合可能導致不同尋常的性質及相關應用。最近，加拿大多倫多大學的Krull小組利用稀土氟化物與石墨烯量子點之間的熒光共振能量轉移，實現了對人血清中大腸桿菌、痢疾志賀菌和抗四環素生物標記物的同時檢測[16]。碳點通過2條互補DNA單鏈的雜交與稀土氟化物彼此接近，伴隨著共振能量轉移石墨烯量子點的熒光下降。因不同材料間存在較大距離，能量轉移的效率非常有限。為了克服這一問題，我們以組氨酸功能化碳點（His-CDs）為穩定劑，采用水熱法合成了一種His-CDs@NaTbF4復合材料。研究表明，碳點對NaTbF4晶體的包覆提高了水溶性，復合物在水中能長期穩定。碳點與NaTbF4的共價結合實現了稀土粒子向碳點的高效能量轉移，導致顯著的熒光增強。該復合材料成功地應用于人體尿液中組氨酸測定和Hela細胞成像。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器有：JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡（日本 JEOL公司）；Nicolet iS50 FT-IR傅立葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Cary Esclipse熒光光度計（美國瓦里安公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）；D8 Advance型X射線衍射儀 （德國Bruker AXS公司），XRD 測試條件：Cu Kα 射線 （λ=0.154 nm）， 管電壓40 kV，管電流 300 mA，掃描范圍 5°～90°。

TbCl3·6H2O、NaF、CuSO4和組氨酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BR緩沖溶液：H3PO4、乙酸和 H3BO3濃度均為 0.04 mol·L-1，用 0.02 mol·L-1NaOH溶液在pH計上調節到所需要的pH值。His-CDs按文獻方法合成[17]。其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑公司。實驗用水為二次去離子水。

1.2 His-CDs@NaTbF4制備

將 TbCl3·6H2O（5 mmol）溶 于 去 離 子 水 中 （15 mL），緩慢滴加 His-CDs溶液（5 mg·mL-1，100 mL），攪拌 30 min。滴加 1.0 mol·L-1NaF 水溶液（60 mL）于上述混合溶液，強力攪拌1 h后轉移至壓力反應釜中，于180℃ 反應4 h，冷卻至室溫，收集上清液，高速離心（10 000 r·m-1）20 min 去除游離的 His-CDs，沉淀用水洗滌3次，冷凍干燥得到His-CDs@/NaTbF4固體樣品。稱取一定量的His-CDs@NaTbF4溶解于水中配成0.3 mg·mL-1的儲備液，在4℃冰箱中避光保存，備用。

1.3 熒光測定

移取200 μL His-CDs@NaTbF4水溶液于5 mL離心管，加入600 μL pH 7的BR緩沖溶液，加水定容至1 mL，混勻，倒入1 cm石英比色皿中，然后在熒光分光光度計上選擇激發波長為340 nm進行熒光光譜掃描或熒光強度測定。

1.4 共振光散射光譜測定

在2 mL離心管中，依次加入200 μL Cu2+標準溶液、600 μL BR 緩沖溶液（pH=7）和 200 μL His-CDs@NaTbF4水溶液，搖勻，然后在熒光光度計上選擇激發波長等于發射波長進行同步掃描測定共振光散射光譜。

1.5 組氨酸檢測

在2 mL離心管中，依次加入200 μL 1.0×10-2mol·L-1Cu2+標準溶液、400 μL BR 緩沖溶液（pH=7）和200 μL His-CDs@NaTbF4溶液，搖勻，加入200 μL組氨酸標準溶液或樣品溶液，在熒光光度計上進行熒光光譜掃描或熒光強度測定。

1.6 細胞成像

將Hela細胞轉移到含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的 DMEM 中，37 ℃、5%（V/V）CO2和 95%（V/V）空氣的潮濕環境下培養。成像實驗前，將細胞轉移至共聚焦專用培養皿，培養6 h后用5 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。將此細胞注入30 mg·mL-1His-CDs@NaTbF4溶液， 于37℃和5%（V/V）CO2的條件下培養 4 h，用 5 mL pH=7.4 的 PBS洗滌3次去除殘余His-CDs@NaTbF4，然后在共聚焦熒光顯微鏡上選擇490 nm激發光進行熒光成像。

2 結果與討論

2.1 His-CDs@NaTbF4合成

His-CDs@NaTbF4合成包括制備His-CDs-Tb和NaTbF4的形成2個步驟。首先，His-CDs通過咪唑氮和羧基氧與Tb3+結合形成穩定的His-CDs-Tb配合物[18]。在配位反應過程中，隨著His-CDs的加入TbCl3溶液由透明狀逐步轉變為混濁，直到產生大量沉淀。這是因為每個碳片含有多個咪唑基團和羧基，不同碳片之間可以通過“Tb3+橋”連接在一起，碳片聚合導致配合物水溶性顯著下降而最終從體系中沉淀析出。沉淀完全后，向體系中加入NaF，并在180℃下水熱反應產生His-CDs@NaTbF4復合物。這一過程中，F-將替代His-CDs-Tb配合物中His-CDs配體而最終形成NaTbF4晶體。一方面，His-CDs對Tb3+的緩釋作用可有效調控NaTbF4晶體生長，從而形成細小且結晶度高的NaTbF4晶體。另一方面，碳片共價鍵合于NaTbF4晶體表面形成親水性包覆層，改善了NaTbF4的水溶性。此外，碳片上含氧基團的離解造成粒子表面帶負電荷，強的靜電排斥進一步提高了His-CDs@NaTbF4水溶液穩定性。

圖1是His-CDs的TEM圖和His-CDs@NaTbF4的TEM、晶格指紋和XRD圖。從圖1可以看出，His-CDs碳片呈現為準零維材料，其碳片尺寸較小，直徑僅為1～3 nm，沒有明顯的團聚。NaTbF4具有明顯的六方晶型結構，晶體大小均一，尺寸在4～6 nm之間，明顯小于傳統水熱法和溶劑熱法所制備的稀土氟化物[19-20]。 晶格指紋圖包含His-CDs的（002）和NaTbF4的（110）衍射峰的晶格。復合物的XRD圖上有 5 個衍射峰，分別位于 17.1°、29.8°、30.4°、42.9°和53.1°，對應于（100），（110），（101），（201）和（211）晶面。這些衍射峰都能在標準卡片中找到（PDF#27-0809），證明形成了六方相NaTbF4。圖1D中XRD衍射峰呈現強而尖的特征，說明NaTbF4有高的結晶度。熱重分析揭示His-CDs@NaTbF4含有33.19%的His-CDs，然而圖1D中并未出現碳材料在22°處的特征衍射峰。這主要是因為His-CDs是一種準零維納米材料，低結晶度降低了在22°處XRD衍射峰的強度。相對于NaTbF4晶體的強衍射峰，His-CDs的衍射峰弱到幾乎觀察不到的程度。

圖2是His-CDs@NaTbF4的EDS圖和紅外光譜。 EDS 分析表明，復合物主要是由 C、N、O、Tb、Y和F元素組成。因為C、N和O主要來源于His-CDs，而Tb、Y和F來源于NaTbF4，上述結果證明復合物中含有His-CDs和NaTbF4。His-CDs@NaTbF4的紅外光譜存在5個強的紅外吸收峰和吸收帶。3 400 cm-1附近的寬峰是O-H和-N-H鍵伸縮振動產生的紅外吸收。1 700 cm-1附近的強峰是-C=O鍵伸縮振動產生的紅外吸收。1 380 cm-1和1 150 cm-1的吸收峰證實-COOH存在。1 650 cm-1處有一明顯的吸收峰對應咪唑基團中C＝N伸縮振動紅外吸收。圖2A中還有許多弱的吸收峰和吸收帶，它們相似于His-CDs的紅外吸收，說明在水熱反應過程中His-CDs的主要功能基團得以較好地保留。

2.2 NaTbF4對His-CDs熒光增強

圖1 His-CDs的 TEM 圖 （A）和 His-CDs@NaTbF4的 TEM （B）、晶格指紋 （C）和 XRD 圖 （D）Fig.1 TEM image （A）of His-CDs and TEM image （B）,lattice fringe image （C）and XRD patterns （D）of His-CDs@NaTbF4

圖2 His-CDs@NaTbF4的 EDS圖 （A）和紅外光譜 （B）Fig.2 EDS image （A）and IR spectrum （B）of His-CDs@NaTbF4

His-CDs@NaTbF4和His-CDs的熒光光譜列于圖3A。His-CDs@NaTbF4的熒光光譜明顯不同于His-CDs。His-CDs的熒光光譜具有較好的對稱性，最大熒光發射波長為440 nm。His-CDs@NaTbF4有一不對稱的熒光光譜，最大熒光發射峰移到425 nm。這是因為His-CDs@NaTbF4是由 His-CDs和NaTbF4復合而成，His-CDs@NaTbF4的熒光光譜包括了His-CDs和NaTbF4兩種材料的熒光發射。圖3A還顯示，His-CDs@NaTbF4有更強的熒光發射，峰熒光強度超過His-CDs的7倍，這說明His-CDs和NaTbF4的結合能產生顯著的熒光增強，且熒光增強效果優于文獻報道（表1）。為了探討熒光增強機理，分別測定了NaTbF4的熒光光譜和His-CDs的吸收光譜。從圖3B可以看出，NaTbF4的熒光光譜位于240～660 nm之間，而His-CDs的吸收光譜覆蓋了250～800 nm的波長范圍。NaTbF4的熒光光譜與His-CDs的吸收光譜有很大程度的重疊，這符合產生熒光共振能量轉移的條件。因此，His-CDs@NaTbF4的熒光強于His-CDs應歸于His-CDs和NaTbF4之間的共振能量轉移。在這一過程中，NaTbF4作為能量供體將能量迅速轉移給His-CDs，帶來His-CDs發光效率的大幅提升。大量研究表明，供體和受體之間的距離是影響熒光共振能量轉移增強的關鍵因素。His-CDs是通過N-Tb共價鍵的方式與NaTbF4相結合，它們之間的距離僅為一個共價鍵的鍵長，能量供體和受體之間如此短的距離使NaTbF4能高效地向His-CDs轉移能量，從而產生更高的熒光增強效應。

圖3 （A）His-CDs@NaTbF4和His-CDs的熒光光譜;（B）His-CDs的紫外-可見吸收光譜和NaTbF4的熒光光譜Fig.3 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4and His-CDs;（B）UV-visible absorption spectrum of His-CDs and fluorescence spectrum of NaTbF4

表1 不同方法熒光增強效果的比較Table 1 Comparison of different fluorescence enhancement methods

2.3 對Cu2+和組氨酸的光學響應

為了研究His-CDs@NaTbF4對 Cu2+的熒光響應，分別測定了Cu2+加入前后His-CDs@NaTbF4的熒光光譜。圖4A呈示，Cu2+的加入引起了一個明顯的熒光猝滅過程。由于His-CDs@NaTbF4的His-CDs含有能與Cu2+發生反應的咪唑基團，上述熒光猝滅可歸因于N-Cu鍵的形成。由于N-Cu形成過程中碳片上的部分能量將轉移到Cu2+離子，從而導致其熒光強度的下降。此外，用共振光散射技術研究了Cu2+加入His-CDs@NaTbF4粒子大小的影響。從圖4B可以看出，隨著銅離子濃度增加，His-CDs@NaTbF4的共振光散射光譜強度迅速增大，說明Cu2+加入導致His-CDs@NaTbF4粒子變大。每一個His-CDs碳片中含有多個咪唑基，它與Cu2+的配位可能發生在不同碳片之間，造成粒子尺寸的迅速增加。

圖4 （A）在 2.0 mmol·L-1Cu2+存在下 （a）和缺少 Cu2+的情況下 （b）His-CDs@NaTbF4 溶液的熒光光譜;（B）在不同濃度 Cu2+存在下His-CDs@NaTbF4溶液的共振光散射光譜Fig.4 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4solution in the presence of 2.0 mmol·L-1Cu2+ （a）and the absence of Cu2+ （b）;（B）Resonance Rayleigh scattering spectra of His-CDs@NaTbF4 solution in the presence of Cu2+with different concentrations

圖5 His-CDs@NaTbF4-Cu 加入組氨酸前 （a）后 （b）的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4-Cu before （a）and after addition of histidine （b）

在His-CDs@NaTbF4溶液中加入適量的Cu2+可將其全部轉化為相應的配合物。研究發現，猝滅的熒光能被組氨酸恢復 （圖5）。在體系中加入組氨酸后，組氨酸將同His-CDs競爭與Cu2+配位。組氨酸的配位能力略強于His-CDs，因此組氨酸能分解His-CDs@NaTbF4-Cu而生成His-Cu配合物。同時，釋放出His-CDs@NaTbF4，從而導致體系熒光增加。

2.4 組氨酸檢測的熒光“開-關”體系

基于His-CDs@NaTbF4對Cu2+和組氨酸的熒光響應行為，構建了測定組氨酸的熒光“開-關”方案（圖6）。在這個熒光“開-關”方案中，先加入 Cu2+猝滅His-CDs@NaTbF4的熒光，體系處于熒光“關”狀態。然后，加入組氨酸分解前面所形成的配合物，同時釋放出His-CDs@NaTbF4使體系的熒光得到一定恢復，體系處于熒光“開”狀態。利用熒光“開”和“關”產生的信號變化可定量測定組氨酸。以上分析方案中，Cu2+發揮著至關重要的作用。為此，我們測定了不同Cu2+存在下體系的熒光變化。結果表明，隨著Cu2+濃度增加體系的熒光強度迅速下降。當Cu2+的濃度達到2 mmol·L-1時，熒光猝滅程度達到最大。繼續增加Cu2+濃度體系熒光強度不再降低，表明His-CDs@NaTbF4已被完全轉化為相應的配合物。對于組氨酸的分析而言，選擇一個較小濃度的Cu2+濃度組氨酸熒光恢復的范圍較小，導致一個相對窄的線性范圍。選擇一個過高的Cu2+濃度體系中將存在游離Cu2+，這些游離Cu2+更容易與組氨酸反應形成穩定的配合物。由于這種反應并不產生熒光信號的變化，導致分析結果失真。為了得到寬的線性范圍和高的可靠性，選取Cu2+濃度為2.0 mmol·L-1用于組氨酸檢測的熒光“開-關”體系構建。

圖6 組氨酸檢測的熒光“開-關”方案Fig.6 Fluorescence “On-Off” scheme for detection of histidine

為驗證熒光“開-關”方案用于微量組氨酸測定的可行性，配制一系列His-CDs@NaTbF4-Cu溶液，分別加入不同量的組氨酸，然后測定它們的熒光光譜和峰熒光強度。圖7顯示，體系的熒光隨組氨酸濃度的增加而增大。當組氨酸濃度在1.0×10-6～2.0×10-4mol·L-1之間，峰熒光強度與組氨酸濃度有良好線性關系。其線性方程為：I=1 072.7c/（mmol·L-1）+169.12，相關系數R=0.995 6，方法檢出限達到3.8×10-7mol·L-1（S/N=3）。 采 用此 方 法測 定 15 個 0.1 mmol·L-1組氨酸，檢測結果標準偏差為1.4%，表明方法具有良好的重現性。將His-CDs@NaTbF4-Cu儲備液在4℃儲存一定時間，然后用于檢測0.1 mmol·L-1組氨酸。儲備液儲存1個月后測定結果相對偏差小于1.9%，表明分析體系有較好的穩定性。

圖7 （A）在不同濃度的組氨酸存在下His-CDs@NaTbF4-Cu溶液的熒光光譜;（B）His-CDs@NaTbF4-Cu的熒光強度與組氨酸濃度的關系曲線Fig.7 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4-Cu solution in the presence of histidine with different concentrations;（B）Linear relationship of fluorescence intensity of His-CDs@NaTbF4-Cu with histidine concentration

生物樣品中主要的無機離子是Na+、Ca2+、Mg2+、CO32-、SO42-和 PO43-。 加入 1.0 mg 的上述離子后，僅帶來His-CDs@NaTbF4-Cu體系熒光強度小于5%的變化。這是因為上述離子本身不能與復合物發生反應形成穩定化合物，也不能將Cu2+從其配合物中置換出來。對生物樣品而言，天然氨基酸最有可能干擾組氨酸的測定。圖8代表不同天然氨基酸存在下His-CDs@NaTbF4-Cu體系的熒光變化。從圖8可以看出，唯有組氨酸的加入能引起明顯的熒光變化。不同于其他氨基酸，組氨酸分子中含有咪唑基，咪唑基對過渡金屬離子具有強的配位能力，因此組氨酸與銅離子形成配合物的能力最強。由于其他氨基酸的引入并不能分解His-CDs@NaTbF4-Cu配合物，所以不干擾組氨酸測定。

表2 人體尿液中組氨酸的測定（N=5）Table 2 Analytical results of histidinein human urine （N=5）

圖8 不同天然氨基酸對體系熒光強度的影響Fig.8 Effect of natural amino acids on the fluorescence intensity of the system

2.5 人體尿液中組氨酸檢測

征集3位健康的自愿者，將他們的1.0 mL尿樣與0.2 mL乙腈充分混合，在3 500 r·min-1下離心10 min，收集的上清液用于組氨酸測定。回收實驗是在尿樣中加入已知濃度的組氨酸標準溶液，然后按實驗方法測定組氨酸濃度，并以此計算回收率。從表2可以看出，測定結果與LC-MS方法相一致，組氨酸回收率95.2%～104.5%，說明方法具有較好的準確性和精密度。

2.6 細胞成像

采用CCK-8方法對His-CDs@NaTbF4的細胞毒性進行測試。結果表明，His-CDs@NaTbF4濃度在0～1 mg·mL-1之間細胞活力保持基本不變，說明His-CDs@NaTbF4具有非常低的細胞毒性。

將Hela細胞在 His-CDs@NaTbF4中孵育 2 h，然后在共聚焦顯微鏡上進行熒光成像。如圖9所示，His-CDs@NaTbF4處理的細胞產生綠色熒光，說明His-CDs@NaTbF4已進入到細胞內部。然而，在同樣條件下用His-CDs處理的細胞熒光卻很弱。可見，His-CDs@NaTbF4低的細胞毒性和強的熒光發射，能廣泛應用于生物成像。

圖9 Hela細胞在His-CDs（左）和 His-CDs@NaTbF4（右）中孵育后的明場 （上）和熒光顯微照片 （下）Fig.9 Bright field image （up）and confocal fluorescence microscopy image （down）of the Hela cells incubated with His-CDs （left）and His-CDs@NaTbF4 （right）

3 結 論

以組氨酸功能化碳點為穩定劑通過水熱合成得到一種粒徑小、結晶度高和易分散于水的稀土氟化物His-CDs@NaTbF4。碳點與稀土氟化物共價連接可實現能量由稀土氟化物向碳點的高效轉移，導致顯著的熒光增強效應。碳點-稀土氟化物復合物具有低的細胞毒性和強的熒光發射，可作為熒光探針廣泛應用于各種生物檢測與成像。研究結果還為開發基于稀土或碳點的功能材料提供了方法和理論指導。

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