響應面法優化大孔樹脂純化杜仲綠原酸工藝研究

（長春工業大學人文信息學院制藥工程系，吉林長春130122）

杜仲（Eucommia ulmoides Olive）為杜仲科杜仲屬植物，名貴滋補藥材，因其富含黃酮、綠原酸、京尼平苷、丁香素二糖苷、中酯素二糖苷等生物活性物質，從而具有補益肝腎、強筋壯骨、調理沖任、固經安胎之功效[1-2]。特別是主要成分綠原酸由于具有抗菌、降壓降脂、保肝利膽、增強機體免疫和美容養顏等保健作用[3]，使得近年以杜仲綠原酸提取物為原料的各類食品在市場不斷增多，然而提取物中鞣質、蛋白質等雜質，嚴重影響綠原酸的純度，進而影響其食用效果，雖然前人已在其提取與分離作出大量工作，但目標產物純度仍較為偏低[4-5]。

大孔樹脂吸附-洗脫作為經典的分離純化技術，具有選擇性高、干擾因素少、可重復循環利用等特點，已廣泛用于食品、醫藥、農業等諸多領域[6-8]。本研究在綠原酸提取工藝基礎上，借鑒響應面法試驗設計原理，采用紫外-可見分光光度法定量分析，探討杜仲綠原酸最佳純化工藝，為其后續開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲干燥葉：亳州道興堂藥材銷售有限公司；綠原酸（定量分析用）：中國藥品生物制品檢定所；乙醇、石油醚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

722型分光光度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；878-A/B型高速多功能粉碎機：常州國華電器有限公司；H-107、DM-130型大孔樹脂：陜西藍深特種樹脂有限公司；ADS-5、ADS-17、ADS-21 型大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；NKA-9型大孔樹脂：南開大學化工廠；RE-201D旋轉蒸發儀：瑞德儀器設備有限公司；SJIA-5FE冷凍干燥機：寧波雙嘉儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

取干燥杜仲葉粉碎完全，過60目篩，稱取40 g，采用70%乙醇溶液回流提取2次，每次1 h，回收乙醇后，置于分液漏斗中，加入石油醚萃取至上層溶液近無色，取下層水液于40℃減壓濃縮后，冷凍干燥備用[9]。

1.3.2 測定方法標準曲線繪制[10]

分析天平精密稱取綠原酸標準品0.2 g，用70%乙醇分別配制濃度為 0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL 標準品溶液，以70%乙醇溶液作空白溶劑，于328 nm最大吸收波長下測定各自吸光度，繪制綠原酸濃度（X）-吸光度（Y）的標準曲線，線性方程為：Y=1.025 X-0.104（r=0.9932），表明綠原酸濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL時，吸光度與其線性關系良好。

1.3.3 樹脂預處理

將大孔樹脂24 h浸泡于90%乙醇中，充分溶脹后濕法裝柱，后用90%乙醇反復沖洗，直至流出液與水混合（體積比為=1∶5）無白色渾濁出現，再用水洗至無乙醇氣味，加入3%鹽酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，用水洗至中性，備用[11]。

1.3.4 樹脂型號選擇

稱取2.0 g 6種極性不同的大孔樹脂（H-107、ADS-5、DM-130、ADS-17、NKA-9、ADS-21）置于錐形瓶內，分別加入等濃度的杜仲綠原酸提取液50 mL后，放入振動器中，靜態吸附24 h，使大孔樹脂吸附綠原酸飽和，隨后過濾，蒸干濾液。通過下式計算得到不同類型大孔樹脂靜態飽和吸附量與吸附率。

式中：m0為提取液綠原酸質量，mg；me為飽和吸附后濾液中綠原酸質量，mg；m為干燥的大孔樹脂質量，g；Γe為靜態飽和吸附量，mg/g；Qe為靜態飽和吸附率，%。

將過濾后的樹脂置于錐形瓶內，加入70%乙醇30 mL，放于振蕩器中，靜態洗脫24 h，過濾，測定濾液綠原酸含量，通過下式計算不同類型樹脂的洗脫率與回收率。

式中：m0為提取液綠原酸質量，mg；me為飽和吸附后濾液中綠原酸質量，mg；md為洗脫液綠原酸質量，mg；Dd為靜態洗脫率，%；R 為回收率，%。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 上樣液質量濃度影響

分別配制20 mL杜仲綠原酸提取液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mg/mL，控制上樣流速 3.0 BV/h，加入至預處理后的DM-130型大孔樹脂內，收集柱后流出液，分別測定其綠原酸含量。

1.3.5.2 洗脫液濃度影響

杜仲綠原酸極性較大，因此選擇一定濃度的乙醇溶液作為洗脫劑，然而乙醇溶液濃度過高，易使得柱內殘余極性較小的雜質被洗脫，濃度過低又導致綠原酸不易洗脫完全，因此選擇合適的洗脫液濃度尤為重要。按前述最佳條件上樣后，分別采用5.0 BV的40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，分別測定其綠原酸含量。

1.3.5.3 洗脫液體積影響

將50 mL濃度為3 mg/mL的杜仲綠原酸提取液，以3.0 BV/h上樣至預處理后的大孔樹脂柱內，吸附結束后，采用體積分別為 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 BV 的50%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，分別測定其綠原酸含量。

1.3.5.4 洗脫流速影響

洗脫流速越慢，洗脫液對樹脂吸附的綠原酸洗脫效果越好，分別對 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h 的洗脫液流速進行洗脫率考察。按照前述最佳條件上樣后，采用5.0 BV 50%乙醇溶液照上述5種不同洗脫流速對吸附的綠原酸洗脫，收集洗脫液，分別測定其綠原酸含量。

1.3.5.5 上樣流速影響

配制3.0 mg/mL杜仲提取液50 mL，分別控制上樣流速 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 BV/h，加入至預處理后的DM-130型大孔樹脂內，收集柱后流出液，分別測定其綠原酸含量。

1.3.6 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken試驗設計原理，以上樣液質量濃度（A）、洗脫液濃度（B）、洗脫液體積（C）、洗脫流速（D）、上樣流速（E）為響應因素，回收率（Y）為響應值，進行五因素三水平的響應面（response surface methodology，RSM）分析試驗，確定杜仲綠原酸的最佳純化工藝。

2 結果與分析

2.1 提取物中綠原酸含量測定

以70%乙醇溶液作為空白對照，精密稱取杜仲綠原酸提取物0.5 g，用70%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中于328 nm波長處測定吸光度，平行測定3次，代入標準曲線方程，計算樣品含量，測定結果見表1所示。

表1 杜仲提取物中綠原酸含量Table 1 The content of chlorogenic acid of Eucommla ulmoides extract

2.2 樹脂型號選擇

表2為不同類型樹脂的靜態吸附與洗脫性能比較。從表2可知，DM-130型大孔樹脂的回收率均高于其它5類樹脂，達到80.6%，這歸因于綠原酸的化學結構上含有羧基和羥基，具有一定的極性，DM-130型大孔樹脂特殊的空間結構與弱極性，恰好與綠原酸產生較好的物理吸附，因此確定其作為純化杜仲綠原酸的吸附樹脂。

表2 不同類型樹脂的靜態吸附與洗脫性能比較Table 2 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

2.3 靜態吸附動力學

根據“1.3.4”中靜態吸附試驗條件，在不同時間段測定DM-130型大孔樹脂靜態吸附綠原酸質量，繪制靜態吸附動力曲線，見圖1所示。

圖1 DM-130型大孔樹脂靜態吸附動力曲線Fig.1 Static adsorption curve of DM-130 macroporousresin

樹脂對綠原酸吸附量隨著時間的增長而增大，在8 h左右趨于飽和，DM-130型大孔樹脂靜態吸附杜仲提取物中綠原酸耗時理想，能夠滿足相關工業生產要求。

2.4 單因素試驗

2.4.1 上樣液質量濃度影響

不同上樣液質量濃度對綠原酸吸附率的影響，見圖2所示。

從圖2可見，當上樣液質量濃度為5.0 mg/mL時，樹脂對綠原酸的吸附率達到89.2%，繼續增大上樣液濃度，吸附率開始下降，因此選擇4.5、5.0、5.5 mg/mL作為上樣液質量濃度的響應因素水平。

2.4.2 洗脫液濃度影響

不同洗脫液濃度對綠原酸洗脫率的影響，見圖3所示。

從圖3可知，當洗脫液為60%乙醇溶液，綠原酸洗脫率達到平衡，因此選擇55%、60%、65%作為洗脫液濃度的響應因素水平。

圖2 上樣液質量濃度對綠原酸回收率影響Fig.2 Effect of loading solution concentration on the recovery of chlorogenic acid

圖3 洗脫液濃度對綠原酸回收率影響Fig.3 Effect of concentration of eluent on the recovery of chlorogenic acid

2.4.3 洗脫液體積影響

不同洗脫液體積對綠原酸的洗脫率影響，見圖4所示。

圖4 洗脫液體積對綠原酸回收率影響Fig.4 Effect of volume of eluent on the recovery of chlorogenic acid

從圖4可見，當洗脫液體積為7.0 BV時，洗脫率達到平衡，因此選擇6.5、7.0、7.5 BV作為洗脫液用量的響應因素水平。

2.4.4 洗脫流速影響

不同洗脫流速對綠原酸洗脫率的影響，見圖5所示。

圖5 洗脫流速對綠原酸回收率影響Fig.5 Effect of flow rate of eluent on the recovery of chlorogenic acid

從圖5可見，隨著洗脫流速的增大，洗脫率不斷減小，考慮生產時間，選擇1.5、2.0、2.5 BV/h作為洗脫流速的響應因素水平。

2.4.5 上樣流速影響

不同上樣流速對綠原酸吸附率的影響，見圖6所示。

圖6 上樣流速對綠原酸回收率影響Fig.6 Effect of flow rate of sample solution on the recovery of chlorogenic acid

從圖6可見，樹脂對綠原酸的吸附率隨著流速的增大而減小，但流速過低，會延長吸附時間，因此綜合考慮，選擇2.5、3.0、3.5 BV/h作為上樣流速的響應因素水平。

2.5 響應面法分析

根據單因素試驗結果，各響應因素水平見表3所示。表4為試驗設計方案與響應結果，對表4進行多元回歸擬合，得到以回收率為目標函數，關于各參數編碼值的二次回歸方程：

Y=90.18+0.28A+0.062B+0.10C+0.36D+0.33E+0.50AB-0.15AC-0.05AD+0.23AE-0.10BC-0.075BD-0.27BE-0.10CD+0.50CE+0.025DE-0.40A2-0.60B2-0.84C2-0.25D2-0.48E2，對該模型進行顯著性檢驗，并進行可信度分析，結果見表5所示。

表3 響應面分析因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface design

表4 Box-Behnken設計方案及結果Table 4 Design and results of the Box-Behnken

續表4 Box-Behnken設計方案及結果Continue table 4 Design and results of the Box-Behnken

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis for the fitted regression mode

從表5可知，該回歸模型P＜0.01，表明該回歸模型對綠原酸回收率具有較好的預測性，同時R2=0.9074與Adj.R2=0.8332都接近于1，表示該模型可靠程度較高，試驗誤差小。變異系數小于1%，說明模型外因素對響應值的影響較小，從而該回歸方程可替代實際值對結果進行分析。一次項A、D、E對綠原酸回收率的影響顯著，二次項 B2、C2、D2、E2對試驗影響結果影響顯著，交互項AB、BE、CE對結果影響顯著，其它交互項影響均不顯著。從F值可知，影響綠原酸回收率的強弱順序為：洗脫流速＞上樣流速＞上樣液質量濃度＞洗脫液體積＞洗脫液濃度。

2.6 響應面模型分析

圖7反映了各兩因素交互作用的響應面。

圖7 各兩因素交互作用的響應面Fig.7 Response surface of different two factors interaction

通過解二次多項回歸擬合方程得到最優條件為：將質量濃度為5.5 mg/mL的杜仲綠原酸提取液，以2.45 BV/h流速上樣至DM-130型大孔樹脂內，隨后采用7.5BV的55%乙醇溶液，以1.87 BV/h流速洗脫，預測最大回收率為90.7%。

2.7 驗證性試驗

為了驗證響應面法所得最佳純化工藝和可實施性，通過試驗確定最佳純化工藝參數。將質量濃度為5.5 mg/mL的杜仲綠原酸提取液，以2.5 BV/h流速上樣至DM-130型大孔樹脂內，隨后采用7.5 BV的55%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，定量分析綠原酸含量，結果見表6所示。

表6 純化前后提取物中綠原酸含量Table 6 The content of chlorogenic acid of extracts before and after purification

從表6可知，綠原酸回收率平均值與預測值較為接近，回收率為90.5%，表明采用響應面法優化得到的杜仲綠原酸提取物純化參數準確可靠，對相關工業生產具有一定指導作用。提取物中綠原酸含量由純化前134.5 mg/g，提高至純化后341.2 mg/g，為純化前的2.5倍。

3 結論

本研究選用6種大孔樹脂純化杜仲提取物中綠原酸，響應面法結果表明：配制5.5 mg/mL的杜仲提取物，以2.5 BV/h流速，上樣至DM-130型大孔樹脂中吸附，隨后采用7.5 BV的55%乙醇溶液，以2.0 BV/h流速洗脫，綠原酸回收率為90.5%，所得洗脫液綠原酸含量為純化前的2.5倍。該工藝操作簡便、純化效率較高，從而適合推廣于相關工業應用。

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