超聲波輔助提取翠云草中穗花杉雙黃酮工藝的響應面優化

賴紅芳，黃秀香，石祖玲

（河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州546300）

翠云草為卷柏屬植物翠云草 [Selaginella uncinata（Desv.）spring]的全草，別名為藍草、龍須、藍地柏、綠絨草等，在廣西、廣東、福建、浙江、安徽以及西南各地等都普遍存在，資源非常豐富[1-2]。其味甘苦，性寒，具有清熱利濕、解毒消淤、止血等功效[3]，還含有豐富的黃酮類、有機酸類、氨基酸、類酚類、生物活性多糖等對人體有益的活性物質[4-5]。其中的穗花杉雙黃酮不僅為卷柏藥材化學檢驗的對照品和質量控制的指標成分[6]，還具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、血管舒張等[7-9]多種生理活性。從文獻報道來看對翠云草中穗花杉雙黃酮的研究并不多，本文擬采用響應面分析法優化翠云草中穗花杉雙黃酮的超聲波輔助提取工藝。利用超聲波提取節能、綠色等優點，結合響應面分析法[10]，在單因素的基礎上，研究幾種因素間交互作用[11-12]。尋求翠云草中穗花杉雙黃酮的最佳提取工藝條件，為其在工業化生產中提供有利的理論依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE-52A型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；Agilent 8453型紫外可見分光光度儀：美國安捷倫科技公司；AUW220D型十萬分之一天平：日本島津公司；KQ2200DE型數控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

翠云草：采自廣西宜州市，經河池學院化學與生物工程學院鄧晰朝副教授鑒定為翠云草（Selaginella uncinata（Desv.）Spring）全草。穗花杉雙黃酮（批號：MUST-15012505，純度大于99.5%）：成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇、丙酮、無水乙醇、氯仿均為分析純。

2 方法與結果

2.1 最大吸收波長的選擇

分別移取1.00 mL穗花杉雙黃酮標準溶液和0.5 mL翠云草提取液于10 mL比色管中，加入體積分數為80%的乙醇定容至10.00 mL，以80%乙醇為空白試劑，用紫外-可見分光光度計全波長掃描。由兩者的譜圖可知在269 nm下有最大吸收峰，故將檢測的最大吸收波長選定為269 nm。

2.2 標準曲線的繪制

精確稱取8.4 mg穗花杉雙黃酮樣品，用80%乙醇稀釋定容至50 mL容量瓶中，制得0.1680 mg/mL穗花杉雙黃酮標準溶液。分別吸取標準液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于比色管中，用80%乙醇稀釋至10 mL。以80%乙醇做空白在269 nm處測其吸光度，繪制標準曲線。結果顯示穗花杉雙黃酮的回歸方程為：y=74.455x+0.0247，r2=0.9997，線性范圍 0.0021 mg/mL～0.0105 mg/mL，結果表明穗花杉雙黃酮在線性范圍內濃度與吸光度呈良好線性關系。

2.3 提取溶劑的選擇

準確稱量5 g翠云草粉末，以功率為100 W，料液比為 1∶20（g/mL），提取溫度為60℃，超聲時間為0.5 h，提取溶劑分別為80%乙醇，80%丙酮，80%氯仿，80%甲醇，超聲兩次，合并兩次濾液，冷卻后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀釋至25 mL，按2.2測其吸光度，測定不同溶劑提取的穗花杉雙黃酮的提取率，選擇合適的提取溶劑，結果見表1。

表1 溶劑的影響Table 1 Effects of solvents

結果顯示用丙酮作為提取劑測得的提取率最高，但是其波譜圖周圍含有雜峰，對穗花杉雙黃酮含量測定影響很大。而用乙醇作為提取劑測得的結果僅此于用丙酮，故考慮到簡便、價格便宜、污染小等特點，最終確定選擇乙醇為最佳提取劑。

2.4 翠云草中穗花杉雙黃酮的測定

將干燥翠云草剪碎后粉碎，過40目篩，保存備用。準確稱量5 g翠云草粉末，以功率為100 W，料液比為1∶20（g/mL），提取溶劑為80%乙醇，提取溫度為60℃，超聲時間為0.5 h，超聲兩次，合并兩次濾液，冷卻后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀釋至25 mL，按2.2測其吸光度，計算其提取率。

2.5 單因素試驗

2.5.1 料液比對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響

準確稱量5 g翠云草粉末，以功率為100 W，提取溶劑為80%乙醇，提取溫度為60℃，超聲時間為0.5 h，改變料液比為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）進行超聲提取，合并兩次濾液，冷卻后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀釋至25 mL，按2.2測其吸光度，計算其提取率。結果見圖1。

圖1 料液比對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of solid/liquid ratio on extraction rate of amentoflavone

由圖1可以看出，提取率隨料液比增加而增大，在1∶20（g/mL）時達到最高值，故將料液比因素考察水平定為 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）。

2.5.2 超聲溫度對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響

準確稱量5 g翠云草粉末，以功率為100 W，料液比為1∶20（g/mL），提取溶劑為80%乙醇，超聲時間為0.5 h，改變超聲溫度為 40、50、60、70、80 ℃進行超聲提取，合并兩次濾液，冷卻后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀釋至25 mL，按2.2測其吸光度，計算其提取率。結果見圖2。

圖2 超聲溫度對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of temperature on extraction rate of amentoflavone

由圖2可以看出，提取率隨溫度升高而增大，在70℃時達到最大值，80℃時，提取率反而降低，說明溫度過高有可能使穗花杉雙黃酮變性氧化，故將溫度因素考察水平定為50、60、70℃。

2.5.3 超聲功率對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響

準確稱量5g翠云草粉末，以料液比為1∶20（g/mL），提取溶劑為80%乙醇，提取溫度為60℃，超聲時間為 0.5 h，改變提取功率為 60、70、80、90、100 W 進行超聲提取，合并兩次濾液，冷卻后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀釋至25 mL，按2.2測其吸光度，計算其提取率。結果見圖3。

圖3 超聲功率對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of power on extraction rate of amentoflavone

由圖3可以看出，最佳提取功率為90 W，故將功率因素考察水平定為80、90、100 W。

2.5.4 溶劑濃度對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響

準確稱量5 g翠云草粉末，以功率為100 W，料液比為1∶20（g/mL），提取溫度為 60℃，超聲時間為 0.5 h，改變乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%進行超聲提取，合并兩次濾液，冷卻后用80%乙醇定容至100 mL，移取0.50 mL提取液于比色管中，用80%乙醇稀釋至25 mL，按2.2測其吸光度，計算其提取率。結果見圖4。

圖4 乙醇濃度對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on extraction rate of amentoflavone

由圖4可以看出，最佳乙醇濃度為60%，故將乙醇濃度因素考察水平定為50%、60%、70%。

2.6 響應面試驗及顯著性分析

根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素及正交試驗影響的試驗結果，選取料液比、提取溫度、提取功率、乙醇濃度4個因素，在正交試驗的基礎上采用三水平四因素的響應面分析法，試驗因素與水平設計見表2。以功率A、溫度B、料液比C、乙醇濃度D為自變量，穗花杉雙黃酮的提取率為響應值，平均每組平行3次，試驗方案及試驗結果見表3。

表2 響應面分析法的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surfaces Method

表3 響應面分析結果Table 3 The results of response surface analysis

通過Design-Espwrt-8.0.6軟件對表中翠云草中穗花杉雙黃酮提取率數據進行響應面回歸分析，得到響應變量（功率A、溫度B、料液比C、乙醇濃度D）與響應值（穗花杉雙黃酮提取率%）之間的多元二次回歸方程。

為了說明二次回歸方程模型的有效性及各因素對響應值的影響程度，對回歸方程模型進行方差分析，結果見表4。

表4 方差分析表Table 4 Table of variance analysis

由表4可知：模型的顯著水平為0.0009（小于0.01），且R2=0.921488，所以這個回歸方差模型是極顯著的。說明試驗設計可靠，所擬合的二次回歸方程合適，應用此模型可以預測不同提取條件下翠云草穗花杉雙黃酮的提取率[13]。由P值可知，方程一次項中乙醇濃度D極顯著，溫度B和料液比C顯著；交互項中BD顯著；二次項 A2、B2、C2、D2均表現為極顯著，說明各個因素對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響不是簡單的線性關系。各個因素對翠云草穗花杉雙黃酮提取率的影響大小排序為：乙醇濃度＞溫度＞料液比＞功率。

2.7 響應面分析

利用等高線和三維曲面圖可以更加直觀地分析各因素及它們的交互作用對響應值的影響，見圖5。

由圖5可知，響應面的坡度直接反映出各因素的交互作用及對穗花杉雙黃酮提取率的顯著性[14]。以圖5I為例，溫度變化的響應值大于功率變化的響應值，說明在交互作用中溫度變化對穗花杉雙黃酮提取率的影響大于料液比變化；以此類推，各個因素的影響大小排序為：乙醇濃度＞溫度＞料液比＞功率。這與方差分析的結果一致。各個因素之間對穗花杉雙黃酮提取率有顯著的交互作用，如圖5Ⅰ所示，隨著提取溫度和提取功率增大，穗花杉雙黃酮提取率先快速提高后緩慢降低，由此可見，適當的增大提取溫度和提取功率，可以一定程度提高穗花杉雙黃酮提取率。但過度增加并不能提高得率。其他圖的分析與圖5Ⅰ相似，因此，在實際操作過程中，應慎重控制提取溫度、提取功率、乙醇濃度及料液比，以獲得較高的提取率[15]。

圖5 乙醇濃度、料液比、提取功率和提取溫度對穗花杉雙黃酮得率的交互影響Fig.5 Interaction effects between ethanol concentration，solid/liquid ratio，power and temperature on the amentoflavone yield

2.8 最優提取工藝確定及模型驗證

由響應面圖分析可知，翠云草中穗花杉雙黃酮提取的最佳工藝條件為：功率為90.28W、溫度為71.03℃、料液比為1∶19.29（g/mL）、乙醇濃度為61.74%。按此條件預測翠云草穗花杉雙黃酮提取率為1.62%。結合實際條件將試驗條件修正為：功率為90 W、溫度為71℃、料液比為 1∶19（g/mL）、乙醇濃度為 62%，此條件下穗花杉雙黃酮提取率為1.53%（平行5次），與預測值相差為5.55%。由于本試驗采用的是KQ2200DE型數控超聲波清洗器，功率和溫度有小偏差，故測量值與預測值之間存在有偏差，但采用響應面試驗優化提取翠云草穗花杉雙黃酮的提取工藝還是有較好的可行性。

3 結論與討論

采用Box－Behnken結合響應面分析法優化超聲輔助提取翠云草中穗花杉雙黃酮，最佳提取條件為：功率為90 W、溫度為 71℃、料液比為 1∶19（g/mL）、乙醇濃度為62%，此條件下穗花杉雙黃酮提取率為1.53%，與預測值相差為5.55%。該回歸方程較真實地反應了各因素對穗花杉雙黃酮提取得率的影響，表明優化超聲輔助提取翠云草中穗花杉雙黃酮的提取工藝具有很好的參考價值和實用價值。

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