響應(yīng)面法優(yōu)化紅薯葉中綠原酸的提取工藝及動力學(xué)分析

何春玫，梁宇寧，項(xiàng)有泳

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530007；2.廣西師范大學(xué)，廣西桂林541004；3.防城港市廣源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，廣西防城港538100）

紅薯又稱為甘薯、蕃薯、地瓜等，是我國主要糧食作物之一。廣西紅薯種植面積一直穩(wěn)定在26.7萬hm2左右，近年來，由于技術(shù)推廣和品種更新，年產(chǎn)量達(dá)600萬t，產(chǎn)值以每年5%的速度增加[1]，紅薯葉資源十分豐富。

綠原酸對人體具有清除自由基、抗菌消炎、利膽清熱等作用，是許多中草藥的有效藥理成分之一[2]。當(dāng)前，國內(nèi)有學(xué)者研究了從金銀花、杜仲、牛蒡、紅薯葉根等植物中提取綠原酸[3-10]，文獻(xiàn)多集中于對不同提取工藝的優(yōu)化，關(guān)于綠原酸提取動力學(xué)研究的報道較少。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以烘干的廣西東興市紅姑娘紅薯葉為原料，采用乙醇浸提法，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝，并對提取過程建立動力學(xué)模型，為進(jìn)一步利用紅薯葉提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

東興市紅姑娘紅薯葉：由防城港市廣源農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司紅姑娘紅薯種植示范基地提供。

1.1.2 主要試劑

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；無水乙醇、石油醚、鹽酸（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DH-400S型電熱恒溫干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；800B臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JP-1000B多功能粉碎機(jī)：永康市久品工貿(mào)有限公司；VIS-722型可見光分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，以適量無水乙醇溶解后定容于25 mL容量瓶中，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取 0、1、2、3、4、5 mL 上述標(biāo)準(zhǔn)液，用無水乙醇稀釋并定容至25 mL，所得綠原酸系列工作液分別相當(dāng)于0、4、8、12、16、20 μg/mL 的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)液。在 200 nm～400 nm波長下對綠原酸標(biāo)液進(jìn)行掃描，在328 nm處出現(xiàn)最大吸收波長。以無水乙醇為參比，測標(biāo)準(zhǔn)系列的A328，以吸光度A328為縱坐標(biāo)、綠原酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程，如圖1所示。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

由圖1可見，綠原酸濃度在0～20 μg/mL范圍內(nèi)與A328值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.2.2 綠原酸的提取工藝及提取率的計(jì)算

將新鮮的紅薯葉洗凈晾干后，于60℃烘干，粉碎過40目篩，備用。準(zhǔn)確稱取1.0 g紅薯葉粉，石油醚處理去除色素等雜質(zhì)，離心，沉淀按料液比1∶20（g/mL）加入乙醇溶液，加HCl溶液調(diào)整溶液pH值，在一定的溫度下，回流提取一定時間，抽濾，定容至200 mL。取提取液1.00 mL稀釋至10 mL，以無水乙醇為參比，測定樣品溶液的吸光度A328，根據(jù)1.2.1回歸方程計(jì)算綠原酸濃度C，提取率。

式中：C為綠原酸濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為紅薯葉粉質(zhì)量，g。

1.2.3 綠原酸提取工藝優(yōu)化設(shè)計(jì)

通過查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，影響醇提紅薯葉綠原酸的因素有前處理方法、乙醇濃度、pH值、提取溫度、提取時間、料液比等[2，6-9]，其中乙醇濃度、pH 值、提取溫度、提取時間對提取率的影響較顯著，擬固定料液比1∶20（g/mL），通過單因素試驗(yàn)考察乙醇濃度、pH值、提取溫度、提取時間的影響水平，利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.4 綠原酸提取過程動力學(xué)分析

利用Origin Pro 8.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，并以Reduced Chi2、R2和Adj-R23個參數(shù)以及離散比較圖評價數(shù)學(xué)模型的擬合程度。Reduced Chi2表示數(shù)據(jù)與擬合曲線的偏離程度；R2表示決定系數(shù)平方；Adj-R2為校正決定系數(shù)平方。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響

調(diào)整溶液pH值為5，提取溫度為60℃，提取時間為30 min，用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液提取綠原酸，測定綠原酸提取率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響Fig.2 Effects of ethanol volume fraction on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖2可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇濃度達(dá)60%時，綠原酸的提取率較高，超過60%后綠原酸的提取率略有下降，原因可能是濃度較大的乙醇溶液會加大溶出一些醇溶性雜質(zhì)，這些物質(zhì)競爭乙醇從而影響了綠原酸的溶出。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇乙醇濃度為60%。

2.1.2 溶液pH值對綠原酸提取率的影響

選擇乙醇濃度為60%，提取溫度為60℃，提取時間為 30 min，分別調(diào)整溶液 pH 值為 1、3、5、7、9 的乙醇溶液提取綠原酸，測定綠原酸提取率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溶液pH值對綠原酸提取率的影響Fig.3 Effects of pH on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖3可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨溶液pH值的增加呈現(xiàn)先略增加后快速減小的趨勢，當(dāng)溶液pH值為3～5時，提取率基本穩(wěn)定，提取效果相當(dāng)，隨后提取率下降較快，原因可能是綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸組成的一類縮酚酸[10]，溶液pH值較大會加快綠原酸的水解而使提取率下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇溶液pH值為5。

2.1.3 提取溫度對綠原酸提取率的影響

固定乙醇濃度為60%，溶液pH值為5，提取時間為 30 min，選取提取溫度分別為 20、40、60、80、100 ℃，測定綠原酸提取率，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨提取溫度的增加呈現(xiàn)先略增大后快速減小的趨勢。60℃左右，提取率較高，當(dāng)溫度高于60℃，隨著提取溫度的升高，因高溫破壞綠原酸，使得提取率下降較快。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇提取溫度為60℃。

圖4 提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on the extraction yield of chlorogenic acid

2.1.4 提取時間對綠原酸提取率的影響

固定乙醇濃度為60%，溶液pH值為5，提取溫度為 60 ℃，選取提取時間分別為 10、20、30、40、50 min，測定綠原酸提取率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effects of extraction time on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖5可見，紅薯葉中綠原酸的提取率隨提取時間的增加呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢。提取時間30 min～50 min左右，提取率基本穩(wěn)定，提取效果相當(dāng)，因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇提取時間為30 min。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及顯著性分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度、pH值、提取溫度、提取時間4個因素的3個較優(yōu)水平，采用Design Expert8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案，以綠原酸提取率作為響應(yīng)值，確定提取最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Continue table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，可得響應(yīng)變量A、B、C、D對提取率（Y）的回歸方程為：

利用Design Expert8.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)模型方差分析，結(jié)果如表3如示。

經(jīng)分析，回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9573，P＜0.0001，說明模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.2755，影響不顯著，說明非試驗(yàn)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響不大；模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.9147，表示可以用此數(shù)學(xué)模型解釋91.47%的變異性；變異系數(shù)C.V%=0.88，說明該回歸模型可信度較高；精密度值=17.01＞4，說明該模型合理，可應(yīng)用該模型預(yù)測和分析紅薯葉綠原酸的提取條件。根據(jù)表3可知，各因素對紅薯葉綠原酸提取率的影響大小順序?yàn)椋簆H值＞提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間，其中pH值和提取溫度的影響極顯著（P＜0.01），乙醇濃度影響顯著（P＜0.05）。

2.3 各因素間交互作用分析

根據(jù)表3可見，影響因素之間A（乙醇濃度）與B（溶液pH值）、A（乙醇濃度）與C（提取溫度）的交互影響極顯著（P＜0.01），B（溶液 pH 值）與C（提取溫度）的交互影響顯著（P＜0.05），其他因素之間的交互作用不顯著。利用回歸模型作各因素間響應(yīng)面圖和等高線圖如圖6所示。

表3 二次響應(yīng)模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of the fitted quadratic regression model

圖6 各因素間交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots

由圖6可見，以上響應(yīng)面圖均為開口向下的平滑曲面，曲面上存在最大響應(yīng)值。綜合各等高線圖發(fā)現(xiàn)，沿溶液pH值方向的曲線較密集，可見溶液pH值的變化對響應(yīng)值的影響較其他因素大。

2.4 最佳工藝條件確定

采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行分析計(jì)算，得出提取紅薯葉綠原酸最佳工藝條件為：乙醇濃度59%，溶液pH4.8，提取溫度57℃，提取時間29 min，提取率預(yù)測值為3.63%。為檢驗(yàn)工藝參數(shù)的準(zhǔn)確性，為方便試驗(yàn)操作，選擇乙醇濃度60%，溶液pH4.8，提取溫度55℃，提取時間29 min，平行3次試驗(yàn)，測得綠原酸提取率為3.597%，相差為-0.91%，說明本回歸模型具有可靠性。

2.5 綠原酸提取的動力學(xué)分析

2.5.1 動力學(xué)數(shù)學(xué)模型的建立

由表3可見，溶液pH值對綠原酸提取率的影響極顯著，本試驗(yàn)固定乙醇濃度為60%和提取溫度60℃，建立動力學(xué)數(shù)學(xué)模型分析不同溶液pH值隨提取時間變化對綠原酸提取率的影響，考察不同溶液pH值下綠原酸的提取率隨提取時間的變化規(guī)律。結(jié)果如圖7所示。

圖7 溶液pH值、提取時間與綠原酸提取率的關(guān)系Fig.7 Relationship between pH，extraction time and extraction rate of chlorogenic acid

由圖7可見，溶液pH值不同，綠原酸的最大提取率不同，溶液pH值過大或過小都會影響綠原酸的提取。溶液pH值較大會加快綠原酸的水解而使提取率下降，溶液pH值較小會影響綠原酸從植物細(xì)胞中溶出而影響提取率。綠原酸溶出在溶劑后，由于自身穩(wěn)定性較弱，隨著時間的延長會略有分解而使提取率下降。

由圖7可見，溶液pH值對綠原酸提取率的影響過程符合多項(xiàng)式模型，采用OriginPro 8.0軟件的多項(xiàng)式函數(shù)對圖7的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，結(jié)果如表4～表7。

R2又稱為擬合優(yōu)度，當(dāng)它越接近1時，表示擬合模型的方程式參考價值越高。Adj-R2調(diào)整了由于參數(shù)個數(shù)帶來的相關(guān)性計(jì)算誤差，它的值越接近1越準(zhǔn)確地評價回歸方程的優(yōu)劣。Reduced Chi2表示數(shù)據(jù)與擬合曲線的偏離程度，它的值越小說明數(shù)據(jù)越接近擬合曲線。由表4～表7可見，采用多項(xiàng)式函數(shù)可以很好地進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，當(dāng)多項(xiàng)式次數(shù)達(dá)5以上，R2達(dá)0.96以上，Adj-R2達(dá)0.93以上。

2.5.2 動力學(xué)數(shù)學(xué)模型考察

為驗(yàn)證所建立的動力學(xué)模型，分別計(jì)算4、5、6、7次多項(xiàng)式模型的擬合點(diǎn)，考察擬合數(shù)據(jù)對擬合方程的離散情況，結(jié)果如圖8所示。

表4 不同溶液pH值的提取動力學(xué)模型4次多項(xiàng)式擬合參數(shù)表Table 4 4 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

表5 不同溶液pH值的提取動力學(xué)模型5次多項(xiàng)式擬合參數(shù)表Table 5 5 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

表6 不同溶液pH值的提取動力學(xué)模型6次多項(xiàng)式擬合參數(shù)表Table 6 6 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

表7 不同溶液pH值的提取動力學(xué)模型7次多項(xiàng)式擬合參數(shù)表Table 7 7 degree polynomial fitting parameter table for extraction kinetics model of different pH solutions

圖8 數(shù)據(jù)對各擬合方程的離散情況Fig.8 The discretization of data to each fitting equation

圖8中，實(shí)線為試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合曲線，點(diǎn)為試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)或擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)。從圖8可見，除4次多項(xiàng)式擬合中pH5的試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合曲線較差外，其余次數(shù)多項(xiàng)式中各試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型的擬合程度都較高。但各次數(shù)多項(xiàng)式的擬合數(shù)據(jù)與模型的擬合程度又各不相同：在6次多項(xiàng)式擬合模型中，pH3、pH5的擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)與擬合曲線偏離較大，在7次多項(xiàng)式擬合模型中，pH5、pH7的擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)與擬合曲線偏離較大，說明所建立6次、7次多項(xiàng)式模型并不理想，模型公式對計(jì)算結(jié)果產(chǎn)生了較大的影響。可見建立多項(xiàng)式模型中，5次多項(xiàng)式模型更能反映紅薯葉中綠原酸提取過程的動力學(xué)規(guī)律。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以烘干的東興紅姑娘紅薯葉為原料，采用乙醇浸提法，以溶液pH值、乙醇濃度、提取溫度和提取時間作為試驗(yàn)因素，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究了從烘干的紅薯葉粉提取綠原酸的最優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度59%，溶液pH4.8，提取溫度57℃，提取時間29 min，提取率預(yù)測值為3.63%。以不同溶液pH值下綠原酸提取率隨時間變化的規(guī)律建立了提取過程動力學(xué)模型，采用Origin－Pro8.0軟件的多項(xiàng)式函數(shù)對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合。經(jīng)擬合模型比較，5次多項(xiàng)式模型更能反映紅薯葉中綠原酸提取過程的動力學(xué)規(guī)律。

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