艾草生物堿提取工藝優化研究

（南陽理工學院生化學院，河南南陽473004）

艾草（Artemisia argyi），又名香艾、艾蒿，為菊科蒿屬多年生草本植物，廣泛分布于北半球的溫帶地區，少數分布于非洲、中美洲及南亞等熱帶地區，在我國主要分布于湖北、湖南、河南、安徽、山東、河北等地[1-2]。其莖、葉有獨特香味[3]，藥食兼用[4]，經加工可制成具有保健功效和藥用價值的功能食品[5-8]。艾草中主要含有精油、生物堿、多糖、黃酮等生物活性成分[9-11]。其中的生物堿類化合物是一種重要的中草藥有效成分，有顯著的抗腫瘤、抗菌、抗過敏、抗心律失常、抗炎癥等藥理活性，具有重要的藥用價值[12-17]。

艾草生物堿的提取具有影響因素較多、高度非線性的特征。BP神經網絡具有強有力的非線性處理能力，可有效表明具有非線性關系的輸入量與輸出量的關聯性，但在實際應用中存在網絡全局搜索能力不足、易陷入局部最優等缺陷[18-20]。遺傳算法是借鑒生物界自然選擇和群體進化機制形成一種全局尋優算法，能優化BP神經網絡的連接權值，可很好地克服BP神經網絡陷入局部最優的缺陷，求出形式未知函數的最優解[21-23]。

在單因素試驗及析因試驗的基礎上，確定對艾草生物堿得率影響顯著的因素，采用Box-Behnken試驗設計對影響顯著的因素進行優化，利用BP神經網絡結合遺傳算法對Box-Behnken試驗的數據進行建模，通過仿真訓練后自尋優，確定最優的艾草生物堿提取工藝參數，以期為艾草生物堿的提取及生理活性研究提供依據。

1 材料

1.1 原料

艾草：南陽市張仲景大藥房，粉碎，過篩，備用。

1.2 試劑

鹽酸小檗堿標準品：中國藥品生物制品檢定所；鹽酸、硫酸、乙醇（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備

BS-210S電子天平：北京塞多利斯天平有限公司；101A-2電熱鼓風干燥箱：上海中光儀器儀表有限公司；HHS-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進醫療器械廠；SHB-III循環水式多用真空泵：鄭州杜甫儀器廠；SHA-C恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；UV-l100可見光分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 艾草生物堿提取流程

艾草→粉碎→過篩→浸提→離心→過濾→低溫風干→艾草生物堿粗品

2.2 艾草生物堿的檢測

艾草生物堿屬喹啉類化合物，在350 nm處有穩定吸收峰，檢測時可先利用鹽酸小檗堿作為對照品繪制標準曲線，提取液經離心后取上清液測其在350 nm波長下的吸光值，與標準曲線進行對照，確定提取液中生物堿的濃度，進而計算生物堿得率[14]。

2.3 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制

精密稱取102℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品2.81 mg，于50 mL容量瓶中以蒸餾水搖勻定容，得濃度為0.0562 mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液。分別吸取鹽酸小檗堿對照品溶液 0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mL 于 10 mL 量瓶中，以 0.05 mol/L 的硫酸定容，350 nm測吸光度值，以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線[24]。

2.4 單因素試驗

分別稱取2.0 g經預處理的艾草原料，根據影響艾草生物堿得率的因素，選擇料液比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間等因素作為考查因素，單因素試驗時，每次固定其中3個因素，考查另一因素對艾草生物堿得率的影響。

2.5 析因試驗設計

在單因素試驗的基礎上，通過Plaekett-Burman試驗設計篩選對艾草生物堿得率影響顯著的因素。Plaekett-Burman試驗設計的因素水平如表1所示。

表1 Plaekett-Burman試驗設計的因素水平表Table 1 Factor and level of Plaekett-Burman experiment design

2.6 Box-Behnken試驗設計

由析因試驗結果可知提取溫度對艾草生物堿得率影響不顯著，故確定提取溫度為65℃，選取料液比、乙醇濃度、提取時間為自變量，以艾草生物堿得率為響應值，采用Box-Behnken試驗設計，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計，因素水平表如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計的因素水平表Table 2 Factor and level of Box-Behnken experiment design

2.7 BP神經網絡模型建立

以Box-Behnken試驗結果中艾草生物堿得率的數據作為BP神經網絡的學習樣本，根據Box-Behnken試驗的因素數和待優化的指標數設計神經網絡的拓撲結構，選擇收斂精度10-4，建立BP神經網絡[25-26]。

2.8 遺傳算法優化

利用遺傳算法對BP神經網絡模型進行全局尋優，以神經網絡的輸出值作為求解的目標函數值，以Box-Behnken試驗設計的數據作為初始種群，種群規模15，交叉概率0.1，變異概率0.1[27-28]。

2.9 艾草生物堿得率的計算

其中：Y為艾草生物堿得率，mg/g；a為提取液吸光度；v為提取液體積，mL；m為原料質量，g。

3 結果與分析

3.1 鹽酸小檗堿標準曲線的繪制結果

鹽酸小檗堿標準曲線的繪制結果見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿標準曲線Fig.1 The standard curve of berberine hydrochloride

以鹽酸小檗堿濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=0.0653x+0.0856，R2=0.998（n=10）。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 料液比對艾草生物堿得率的影響

料液比對艾草生物堿得率的影響見圖2。

圖2 料液比對艾草生物堿得率的影響Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on yield of Artemisia argyi alkaloids

由圖2可知，隨著料液比的增大，生物堿得率逐漸升高，當料液比大于1∶40（g/mL）時，隨料液比的增大，生物堿得率增加緩慢。可能是料液比達到一定比例時，提取體系處于動態平衡，再增大料液比生物堿得率增加不明顯。

3.2.2 乙醇濃度對艾草生物堿得率的影響

乙醇濃度對艾草生物堿得率的影響見圖3。

由圖3可知，當乙醇濃度小于70%時，隨乙醇濃度的增加，艾草生物堿得率逐漸增大，乙醇濃度大于70%，隨乙醇濃度增加，艾草生物堿得率呈下降趨勢。

圖3 乙醇濃度對艾草生物堿得率的影響Fig.3 The effect of ethanol concentration on yield of Artemisia argyi alkaloids

3.2.3 提取溫度對艾草生物堿得率的影響

提取溫度對艾草生物堿得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對艾草生物堿得率的影響Fig.4 The effect of extraction temperature on yield of Artemisia argyi alkaloids

由圖4可知，在65℃～75℃，隨著提取溫度升高，艾草生物堿的得率逐漸增加，當溫度超過75℃，艾草生物堿的得率呈下降趨勢，可能是溫度過高使生物堿部分降解或異構化，導致得率降低。

3.2.4 提取時間對艾草生物堿得率的影響

提取時間對艾草生物堿得率的影響見圖5。

圖5 提取時間對艾草生物堿得率的影響Fig.5 The effect of extraction time on yield of Artemisia argyi alkaloids

由圖5可知，隨提取時間的增加，艾草生物堿得率逐漸提高，提取時間大于100 min時，隨提取時間的延長，生物堿得率趨于穩定。這可能達到一定提取時間，生物堿已充分溶出，再增大提取時間對生物堿得率影響不大。

3.3 析因試驗及結果

析因試驗試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 析因試驗結果Table 3 The results of factorial experiment

表4 方差分析表Table 4 The analysis of variance table

從方差分析表中可以看出，料液比、乙醇濃度和提取時間為顯著性因子，提取溫度對艾草生物堿的影響不顯著，故選擇料液比、乙醇濃度和提取時間作為響應面分析試驗的考察因素，以確定這些因素的最優水平。根據效應分析的原則，選擇提取溫度為65℃進行Box-Behnken試驗。

3.4 BP神經網絡模型建立

Box-Behnken試驗結果見表5。

表5 Box-Behnken試驗結果Table 5 The results of Box-Behnken experiment

根據Box-Behnken試驗的結果，采用BP神經網絡建立Box-Behnken試驗的數學模型，BP神經網絡的學習及訓練過程如圖6所示。

圖6 BP神經網絡訓練過程Fig.6 The training process of BP neural network

由圖6知，隨訓練次數增多，BP神經網絡的訓練誤差平方和逐漸減小，經15512次訓練，神經網絡收斂，收斂精度達10-4。

3.5 遺傳算法優化結果

遺傳算法尋優過程見圖7。

經過200代遺傳進化，遺傳算法預測的最佳參數為：料液比1∶46.5830（g/mL），乙醇濃度50.0065%，提取時間85.2250 min；艾草生物堿得率為0.3859 mg/g。為便于實際操作，將遺傳算法預測的最佳工藝參數修正為：料液比1∶47（g/mL），乙醇濃度 50%，提取時間85 min。

圖7 遺傳算法尋優過程Fig.7 The optimizing computation process of genetic algorithm

3.6 最優提取工藝的驗證試驗

根據單因素及析因試驗結果，并與遺傳算法理論預測修正后的提取條件相結合，確定艾草生物堿最優提取工藝參數為：料液比1∶47（g/mL），乙醇濃度50%，提取時間85 min，提取溫度65℃，根據此條件進行3次驗證試驗取平均值，結果為0.3827 mg/g。

4 結論

1）利用Box-Behnken試驗中的因素水平及待優化的試驗指標數設計BP神經網絡的結構，利用Box-Behnken試驗數據，采用BP神經網絡建立料液比、乙醇濃度、提取時間與艾草生物堿得率之間關系的數學模型，經15512次學習訓練，神經網絡模型收斂，收斂精度達10-4，說明所建立的神經網絡模型逼近能力較強，可將此模型應用于這3個提取工藝參數的優化。

2）結合單因素、析因試驗結果，并與遺傳算法預測修正后的提取參數相結合，得到艾草生物堿最優的提取工藝參數為：料液比1∶47（g/mL），乙醇濃度50%，提取時間85 min，提取溫度65℃。在此條件下，艾草生物堿得率可達0.3827 mg/g。

3）采用BP神經網絡和遺傳算法結合對艾草生物堿的提取工藝參數進行優化可靠性較高，能夠為進一步的試驗研究提供依據。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015

[2] 何姿,夏道宗,吳曉敏,等.艾草總黃酮的提取工藝優化及抗氧化活性研究[J].中華中醫藥學刊,2013,31(7):1550-1552

[3] 況偉,劉志偉,張晨,等.艾草抗氧化活性物質的提取分離[J].中國食品添加劑,2015(6):109-113

[4] 何義雁,張珺,朱香燕,等.響應面法優化微波輔助提取艾草黃酮工藝[J].食品研究與開發,2015,36(4):68-73

[5]張振環.艾草火腿腸的加工工藝研究[D].合肥:合肥工業大學,2012

[6] 孟俊祥,張書光,方紅美,等.艾葉粉對馬鈴薯粉絲品質的影響[J].食品科學,2013,34(3):133-136

[7] 姚勇芳,石琳,譚才鄧.艾草中抑菌物質的提取研究[J].食品科技,2011(10):98-100

[8] 馬爍,吳朝霞,張琦,等.艾蒿中黃酮的提取純化及抑菌實驗[J].中國食品添加劑,2011,2(8):71-78

[9] 譚冰,嚴煥寧,黃鎖義,等.艾葉多糖的提取、含量測定及對裝自由基清除作用的研究[J].中國執業藥師,2012,9(3):10-13

[10]Zhang L B,Lv J L,Chen H L.Chemical constituents from Artemisia argyi and their chemotaxonomic significance[J].Biochemical systematics and ecology,2013,50:455-458

[11]Bao X L,Yuan H H,Wang C Z.Antitumor and immunomodulatory activities of a polysaccharide from Artemisia argyi[J].Carbohydrate polymers,2013,98(1):1236-1243

[12]張明發,沈雅琴.甘草及其活性成分抗炎與抗炎機制的研究進展[J].現代藥物與臨床,2011,26(4):261-268

[13]藍娟,何雷萍,蘇夢翔,等.炙甘草配伍對附子水煎液中烏頭類生物堿的含量和離體腸吸收的影響[J].中國醫科大學學報,2012,43(5):430-434

[14]于淼,柏云嬌,代岐昌,等.響應曲面法優化文殊蘭中生物堿的提取工藝[J].中草藥,2013,44(10):1286-1289

[15]劉永紅,郭建宏,劉文婷,等.藥用植物半夏生物堿類成分研究進展[J].西北農林科技大學學報,2015,43(9):171-177

[16]Yuan Z Q,X H Xiao.Dynamic pH junction high-speed countercurrent chromatography coupled with microwave-assisted extraction for online separation and purification of alkaloids from Stephania cepharantha[J].Journal of Chromatography A,2013,1317:203-210

[17]SUN C L,W J DUAN.Combinative Application of pH-Zone-Refining Counter-Current Chromatography and Preparative HPLC for the Separation of Alkaloids From Lycoris radiata[J].Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,2015,38:1031-1036

[18]王德明,王莉,張廣明.基于遺傳BP神經網絡的短期風速預測模型[J].浙江大學學報:工學版,2012,46(5):837-841

[19]張宏,馬巖,李勇,等.基于遺傳BP神經網絡的核桃破裂功預測模型[J].農業工程學報,2014,30(18):78-84

[20]王睿,漆泰岳,馮劍,等.基于遺傳算法的BP神經網絡隧道施工參數正反演分析與應用[J].鐵道學報,2016,38(4):98-104

[21]劉春艷,凌建春,寇林元,等.GA-BP神經網絡與BP神經網絡性能比較[J].中國衛生統計,2013,30(2):173-181

[22]秦國華,謝文斌,王華敏,等.基于神經網絡與遺傳算法的刀具磨損檢測與控制[J].光學精密工程,2015,23(5):1314-1321

[23]劉浩然,趙翠香,李軒,等.一種基于改進遺傳算法的神經網絡優化算法研究[J].儀器儀表學報,2016,37(7):1573-1579

[24]徐蓉,陳鈞,徐驊,等.響應面法優化黃連黃柏中總生物堿的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2009,15(9):26-29

[25]劉春,馬穎.遺傳算法和神經網絡結合的PSD非線性校正[J].電子測量與儀器學報,2015,29(8):1157-1163

[26]飛思科技產品研發中心.神經網絡理論與MATLAB7實現[M].北京:電子工業出版社,2005

[27]彭基偉,呂文華,行鴻彥,等.基于改進GA-BP神經網絡的濕度傳感器的溫度補償[J].儀器儀表學報,2013,34(1):153-160

[28]叢爽.面向MATLAB工具箱的神經網絡理論與應用[M].合肥:中國科學技術大學出版社,2009