HPLC法測定8個不同產地絞股藍中4種人參皂苷類成分的含量

馬澤剛，黃春花，鐘輝云，吳秀麗，周禮仕，劉卓

（1.四川衛生康復職業學院藥學系，四川自貢643000；2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽621000）

絞股藍 Gynostemma pentaphyllum（Thunb）Makino系葫蘆科Cucurbitaceae絞股藍屬Gynostemma多年生草質藤本植物[1]。《中藥大辭典》名七葉膽，別名小苦藥、遍地生根、五葉參，日本名甘茶蔓等[2-4]。該屬植物基源復雜、品種繁多，我國有14種和3變種[5]，廣泛分布于陜西、四川、湖北、福建、云南等地。絞股藍中含有皂苷、多糖、黃酮類等化合物及鐵、鋅、銅、錳、硒等20多種微量元素[6]。絞股藍皂苷具有達瑪烷型的三萜骨架，與人參皂苷結構類似，是目前研究唯一在五加科植物以外被發現含有人參皂苷類成分的植物[7]。故而有“南方人參”、“第二人參”的美譽[8-10]。迄今為止，從絞股藍分離和鑒定的化物中，共有8種皂苷為人參皂苷，分別為Ginsenoside Rb1、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg3、malonyl-Rd、Rf[7]。人參皂苷Rb1具有多種藥理活性，是一種具有顯著藥用價值的化學物質。它對于中樞神經系統有一定的作用，具有促進學習記憶能力，增強認知能力等促智作用[11]，同時對腦缺血損傷[12]和神經損傷[13]有一定保護作用。人參皂苷Rb1對心血管系統也有作用，有研究表明它對缺血再灌注心肌細胞凋亡有抑制作用[14]，可以對抗同型半胱氨酸引起的血管內膜增生，減弱其引起的血管內膜增生的程度[15]。同時人參皂苷Rb1可以抗腫瘤[16]，降血糖[17]，對于免疫系統[18]的調節也有一定的重要作用。人參皂苷Rb3在神經系統、心血管系統、血液系統也有一定的的作用。有研究表明，人參皂苷Rb3可以保護缺血時心肌功能、抑制血管平滑肌細胞增生[19]。對血液系統的作用，人參皂苷Rb3主要表現在抑制血小板活化聚集，防止血栓的形成[20]。人參皂苷Rd藥理顯著，除有與其他人參皂苷類似的作用外[21]，還具有抗氧化、抗衰老、鎮痛、調節免疫、抗腫瘤抗炎[21-22]等獨特的藥理作用。文獻報道，人參皂苷Rc對抗腫瘤、治療心腦血管疾病方面也有良好的表現[23]。

絞股藍皂苷是絞股藍的顯著藥效成分[24-25]，藥用效果與人參皂苷相似[26]，國內外均有研究證明絞股藍皂苷具有明顯的抗腫瘤，降血脂，抗疲勞，保肝等作用[27]。由于絞股藍產地較多，各地品質差異性較大，故絞股藍皂苷成分含量的準確定量是開發絞股藍優質資源的必要條件。目前文獻報道關于絞股藍皂苷含量的分析方法較多，但采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定絞股藍藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd的研究較少，而這4種人參皂苷也是絞股藍中藥理活性比較高的成分。本文采用HPLC法同時測定了陜西、湖北、江西、內蒙、廣東、福建、云南和四川8個不同產地絞股藍藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd這4種皂苷的含量，為絞股藍的質量控制和深入研究提供了一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍藥材（分別來自陜西、湖北、江西、內蒙、廣東、福建、云南和四川）經四川衛生康復職業學院副主任藥師鐘輝云鑒定為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍[Gynostemma pentaphyllum（Thunb）Makino]；對照品 Rb1、Rb3、Rc、Rd：成都瑞芬思生物科技公司，經HPLC面積歸一化法測定，純度為＞98%。乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國Sigma試劑公司；乙醇、正丁醇、氯仿（均為國產分析純）：成都市科龍化工試劑廠；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器與設備

KQ5200B型超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-5286A型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；AE240電子天平：瑞士Metter Toledo公司；高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

美國SunFireTM-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱；流動相為乙腈-水；梯度洗脫，時間程序為0～10 min～15 min～25 min～30 min，乙腈體積分數相應為30%～35%～40%～50%～60%；流速為0.8 mL/min；柱溫為25℃；檢測波長203 nm，進樣量10 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備

準確稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷 Rd 對照品 3.0、2.0、3.0、1.0 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，充分搖勻，制成混合對照品儲備液。

1.3.3 供試品溶液制備

根據本試驗前期的研究，得出絞股藍總皂苷最佳的提取工藝，即取1.0 g干燥的絞股藍粗粉，在60℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比為1∶10（g/mL）。故準確稱取8個不同產地絞股藍粗粉各1.0 g，分別置于圓底燒瓶中，加入10 mL 60%乙醇溶液，在60℃條件下，回流提取4次，每次2 h。合并提取液，過濾，將濾液蒸干，用10 mL水溶解，再用10 mL氯仿萃取，水層用10 mL正丁醇萃取，正丁醇層蒸干，浸膏用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 線性關系考察

準確吸取混合對照品儲備液適量，按“1.3.1”項下色譜條件分別進量20 μL，確定標準物質的保留時間，然后將對照品儲備液用甲醇稀釋至4、8、16、32、64倍，振蕩均勻，作為對照品稀釋液。按“1.3.1”項下色譜條件分別進量20 μL，平行測定3次，以平均峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸。各物質的回歸方程、相關系數和線性范圍見表1。

人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd這4種成分在線性范圍內與峰面積線性關系良好。對照品色譜圖見圖1。

表1 對照品的線性關系（n=4）Table 1 Regression equations of reference substances（n=4）

圖1 對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances

2.2 精密度試驗

準確吸取混合對照品溶液10μL，按“1.3.1”項下色譜條件分別連續進樣5次，記錄各自的峰面積，并計算其相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值。結果人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD值分別為0.56%、0.34%、0.61%、0.89%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗

準確稱取江西絞股藍1.0 g，按“1.3.3”項下方法制得供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件分別于0、4、6、8、12、16、20、24 h 測定各成分的峰面積。結果人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD 分別為 0.23%、0.64%、0.31%、0.74%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4 重復性試驗

準確稱取江西絞股藍6份，按“1.3.3”項下方法制得供試品溶液，按“1.3.1”項下色譜條件進行測定。結果人參皂苷 Rb1、Rb3、Rc、Rd 含量的 RSD 值分別為1.32%、0.98%、1.53%、1.67%，表明該方法重復性好。

2.5 加樣回收率試驗

取江西絞股藍5份，每份1.0 g，準確稱定，并分別準確加入各對照品，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd的加入量分別為0.088、11.759、0.234、1.373 mg。按“1.3.3”項下制備供試溶液后，按“1.3.1”項下色譜條件進行測定。結果人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd的平均加樣回收率（n=5）分別為：99.0%、99.3%、99.2%、99.5%；RSD分別為1.51%、1.23%、1.06%、1.46%，表明該方法具有良好的回收率。

2.6 樣品的測定

根據本試驗前期研究，得出絞股藍總皂苷最佳提取工藝，即取1.0 g不同產地干燥的絞股藍粗粉，在60℃條件下，60%乙醇回流提取4次，每次2 h，料液比為1∶10（g/mL），根據最佳工藝提取絞股藍，可以最大化利用其價值，并根據該工藝，按“1.3.3”項下方法，制備供試品溶液。準確吸取不同產地絞股藍供試品溶液20 μL，按“1.3.1”項下色譜條件測定峰面積，并用外標法計算樣品中人參皂苷 Rb1、Rb3、Rc、Rd 的量，結果見表2。

表2 8個不同產地絞股藍藥材中4種人參皂苷類成分的含量測定結果Table 2 The determination results of the four saponins in 8 samples from different producing areas

采用HPLC法對來自陜西、云南、四川等8個不同產地的絞股藍藥材中人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd的含量進行測定，見表2。

結果表明內蒙古產的絞股藍中人參皂苷Rb1含量最大，江西產的絞股藍中人參皂苷Rb3含量最大，湖北產的絞股藍中人參皂苷Rc含量最大，江西產的絞股藍中人參皂苷Rd含量最大。除湖北、四川的絞股藍以外，其他產地的絞股藍中人參皂苷Rb3的含量大于人參皂苷Rb1。福建產的絞股藍中人參皂苷Rb1、內蒙古產的絞股藍中人參皂苷Rc和四川產的絞股藍中人參皂苷Rd含量未檢測出。不同產地的絞股藍人參皂苷成分在組成和含量上存在一定的差異，這可能是由于生長環境的不同造成的。本試驗數據對絞股藍人參皂苷成分及含量的深入研究提供一定的試驗依據。

3 結論與討論

本試驗所采用的HPLC法對8個不同產地絞股藍中4種人參皂苷類成分的含量進行測定，經方法學驗證，該試驗準確度回收率較高，操作可行，是一種檢測絞股藍中人參皂苷含量的有效方法。研究結果表明不同產地的絞股藍人參皂苷成分在組成和含量上存在一定的差異，綜合考慮，廣東和江西產的絞股藍中4種人參皂苷在成分和含量上都較為占優勢。所以有必要對該地區產的絞股藍種植進行規范化處理，完善質量監管機制。

本試驗在前期研究中，已經摸索出絞股藍總皂苷的最佳提取工藝，根據該工藝對不同產地的絞股藍進行提取，可以充分利用其價值，進而對人參皂苷Rb1、Rb3、Rc、Rd的含量進行測定，其測定結果可靠。在測定各不同產地絞股藍4種人參皂苷中，只有福建產的絞股藍人參皂苷Rb1、內蒙古產的絞股藍人參皂苷Rc和四川產的絞股藍人參皂苷Rd含量未檢測出，可能是由于這3種產地的絞股藍中人參皂苷Rb1、Rc和Rd含量極低，導致幾乎沒有紫外吸收，使紫外檢測器對其不能起到檢測作用。該試驗中絕大部分產地的絞股藍中人參皂苷Rb3的含量高于人參皂苷Rb1，可見除人參皂苷Rb1外，人參皂苷Rb3也可作為絞股藍皂苷含量測定的對照品。截至目前，絞股藍尚未被《中國藥典》收錄，這可能是由于對于絞股藍化學成分的結構、作用機理、活性大小與結構和構象之間的關系還不明確。同時，由于絞股藍產地廣泛，成分和含量上差異顯著，導致各地質量標準不統一，所以亟待建立可靠的絞股藍質量評估體系。本試驗采用的HPLC法對8個不同產地絞股藍中4種人參皂苷成分含量進行測定，為絞股藍質量控制評價體系，以及后續的研究提供了一定的試驗依據。

[1]陳書坤.絞股藍屬植物的分類系統和分布[J].植物分類學報,1995,33(4):403-410

[2] 何顯忠,邱江沁.絞股藍化學成分和藥理作用研究進展[J].中國中醫藥信息雜志,2008,1(增刊):84-86

[3] 孫萬森,吳喜利,喬成林,等.絞股藍總皂苷防治多臟器損傷的藥理研究進展[J].中成藥,2007,30(2):241-244

[4] 李金青,楊洪軍.絞股藍的藥理作用研究進展[J].中國現代藥物應用,2009,3(7):189-190

[5] 丁樹利,朱兆儀,李勇.絞股藍及同屬植物的生藥學研究[J].中國藥學雜志,1994,29(2):79-83

[6] 金亭亭,孫兆林,江蔚新.絞股藍化學成分及藥理作用研究進展[J].亞太統醫藥,2014,10(16):30-32

[7] 向文娟.兩種藥用植物皂苷類成分的化學研究[D].上海:華東理工大學,2011:1-5

[8] 張曉喻,黎艷,雍彬,等.復方絞股藍皂苷改善小鼠學習記憶的研究[J].食品科學,2007,28(3):330-333

[9]周建華,張興亞.絞股藍開發研究新進展及應用[J].食品科技,2010,35(2):74-77

[10]彭亮,李詒,陳杰,等.HPLC測定不同產地、不同品種絞股藍中蘆丁和槲皮素的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(6):45-47

[11]楊秋婭,李曉宇,劉皋林.人參皂苷Rb1的藥理作用研究進展[J].中國藥學雜志,2013,48(15):1233-1237

[12]GAO X Q,YANG C X,CHEN G J,et al.Ginsenoside Rb1 regulates the expressions of brain-derived neurotrophic factor and caspase-3 and induces neurogenesis in rats with experimental cerebral ischemia[J].J Ethnopharmacol,2010,132(2):393-399

[13]LIANG W,GE S,YANG L,et al.Ginsenosides Rb1 and Rg1 promote proliferation and expression of neurotrophic factors in primary Schwann cell cultures[J].Brain Res,2010,1357:19-25

[14]GUAN L,LI W Z,LIU Z X.Effect of ginsenoside-Rb1 on cardiomyocyte apoptosis after ischemia and reperfusion in rats[J].J Huazhong U Sci-Med,2002,22(3):212-215

[15]OHASHI R,YAN S,MU H,et al.Effects of homocysteine and ginsenoside Rb1 on endothelial proliferation and superoxide anionproduction[J].J Surg Res,2006,133(2):89-94

[16]LEUNG K W,CHEUNG L W T,PON Y L,et al.Ginsenoside Rb1 inhibits tube-like structure formation of endothelial cells by regulating pigment epithelium-derived factor through the oestrogen beta receptor[J].Br J Pharmacol,2007,152(2):207-215

[17]YANG C Y,WANG J,ZHAO Y,et al.Anti-diabetic effects of Panax notoginseng saponins and its major anti-hyperglycemic components[J].J Ethnopharmacol,2010,130(2):231-236

[18]RIVERA E,PETTERSSON F E,INGANAS M,et al.The Rb1 fraction of ginseng elicits a balanced Th1 and Th2 immune response[J].Vaccine,2005,23(46/47):5411-5419

[19]Wang T,Yu X,Qu S,et al.Effect of ginsenoside Rb3 on myocardial injury and heart function impairment induced by isoproterenol in rats[J].Eur J Pharmacol,2010,636(1/3):121-125

[20]崔秀明,徐珞珊,王強.人參皂苷Rb3的抗血小板和抗血栓作用[J].中成藥,2006,28(10):1526-1528

[21]周超群,周珮.人參皂苷Rd的研究進展[J].中草藥,2009,40(5):832-836

[22]Yang Z G,Sun H X,Ye Y P.Ginsenoside Rd from Panax notoginseng is cytotoxic towards HeLa cancer cells and induces apoptosis[J].Chem Biodivers,2006,3:187-197

[23]王桂英.HPLC法測定西洋參中五種皂苷方法研究[J].光明中醫,2014,29(4):890-893

[24]C Müller,A Gardemann,G Keilhoff,et al.Prevention of FreeFatty Acid-induced Lipid Accumulation,Oxidative Stress,and Cell Death in Primary Hepatocyte Cultures By a Gynostemma Pentaphyllum Extract[J].Phytomedicine,2012,19(5):395-401

[25]樸香蘭,吳倩.絞股藍研究進展[J].時珍國醫國藥,2010,21(7):1758-1760

[26]Attawish A,CHivapat S,Phadungpat S,et al.Chronic toxicity of Gynostemma pentaphyllum[J].Fitoterapia,2004,75:539-551

[27]李金清,楊洪金.絞股藍的藥理作用研究進展[J].中國現代藥物應用,2009,3(7):189-190