黑果枸杞花青素類型、含量及結(jié)構(gòu)分析研究

杭園園，李悅，王朝警，束彤，陳虎，王茜，王樹林，，*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016；2.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，青海西寧810016）

花青素（anthocyanidin），是自然界中常見的水溶性色素，是一種強有力的抗氧化劑，其基本結(jié)構(gòu)為3，5，7-三羥基-2-苯基苯并吡喃，通常以糖苷化和酰基化的形式存在[1-7]。目前已知的花青素有23種，最常見的是飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素和錦葵素6種[8]。

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）系茄科枸杞屬植物，因其耐干旱性強，有保持水土的作用，又易栽培，因此作為近年來的研究熱點[9-11]。當前，國內(nèi)外對花青素采用的便捷且有效的方法就是輔助（微波、超聲波等）提取法[12-13]。花青素的純化主要采用大孔樹脂吸附法、柱層析法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和膜分離法等方法[14-15]。

目前，各國學(xué)者對紫薯、紫甘藍以及藍莓等紫色蔬果中所含花青素的類型及結(jié)構(gòu)的研究多采用紫外-可見光譜法、HPLC法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）法等方法，其中HPLC法是檢測花青素含量的最常用手段之一[16-20]。但關(guān)于黑果枸杞花青素類型及結(jié)構(gòu)分析的研究并不多見，目前，國外學(xué)者及國內(nèi)學(xué)者對黑枸杞花青素的結(jié)構(gòu)類型仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論[9，15]。譚亮[9]對黑枸杞花青素結(jié)構(gòu)進行了分析，確定了8種花色苷成分，但發(fā)現(xiàn)其中并不含有矢車菊素，但是呂玉嬌[15]對黑果枸杞花青素的研究中發(fā)現(xiàn)含有4種花色苷成分，且包含矢車菊素，同時由于檢測結(jié)果有限因此未能進一步確定其他花青素。經(jīng)過對比，譚亮和呂玉嬌二人所得出的結(jié)構(gòu)并不一致，因此對黑果枸杞花青素的研究還需進一步深入。

本試驗采用HPLC以及HPLC-MS結(jié)合的方法對黑果枸杞花青素進行了定量以及定性分析，為鑒定黑枸杞花色苷的成分和含量提供了一種有效的檢測方法，為黑枸杞花青素資源的開發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)，提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器設(shè)備

黑果枸杞粉末：市售，鮮果冷凍干燥并粉碎；乙腈：色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司；甲酸：色譜純，天津市富宇精細化工有限公司；花青素標準品（氯化飛燕草素、氯化矢車菊素、氯化矮牽牛素、氯化天竺葵素、氯化芍藥素、氯化錦葵素）：ChromaDex公司。

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH-8電熱恒溫水槽：上海比朗儀器有限公司；分UV-2600光光度計：上海精密儀器廠；H1650低溫離心機：上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；ESJ110-4B電子天平：沈陽龍騰電子有限公司；SB-3200DTD超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-IC-50冷凍干燥機：上海比朗儀器有限公司；Agilent1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜法黑果枸杞花青素樣品預(yù)處理

將黑枸杞粉末用70%乙醇溶解，采用超聲波提取法提取花青素，純化后濃縮并冷凍干燥，即可得到黑枸杞花青素粉末[21-24]。稱取樣品花青素粉末10 mg，用體積比為乙醇 ∶水 ∶HCl溶液（3mol/L）=3∶2∶1的溶液溶解于10 mL容量瓶中，在沸水中水解后，立即冷卻，用溶解液補充揮發(fā)的液體，定容至10 mL，過濾膜，用高效液相色譜法進行測定。

1.2.2 花青素標準曲線的建立

用體積比為乙醇 ∶水 ∶HCl溶液（3 mol/L）=3∶2∶1的溶液溶解花青素，并分別配制200 μg/mL的花青素標準品溶液，逐級稀釋，建立以峰面積為縱坐標（y），以濃度為橫坐標（x）的標準方程。

1.2.3 高效液相色譜進樣條件

進樣條件根據(jù)相關(guān)文獻做出一定修改[26]。

色譜柱：Waters C18 柱，5 μm，4.6 mm×250 mm；檢測波長：525 nm；流動相A：1%甲酸溶液；流動相B：1%甲酸乙腈溶液；流速：0.7 mL/min；恒溫柱箱溫度：30℃；進樣量體積：20 μL。

梯度洗脫程序：0～10 min：93%～75%，A%；10 min～15 min，75%～63%，A%；15 min～23 min，63%～25%，A%；23 min～30 min，25%～93%，A%。

1.2.4 高效液相色譜測定條件的優(yōu)化

1.2.4.1 樣品水解時間

取預(yù)處理的樣品液在沸水中分別水解34、47、60、73 min后，立即冷卻，用溶解液補充揮發(fā)的液體，定容至10 mL，過濾膜，按1.2.3的方法進行測定[25]。

1.2.4.2 進樣流速

取預(yù)處理的樣品液，對進樣流速分別為0.3、0.5、0.7、0.9 mL/min進行研究，并確定最佳流速。

1.2.4.3 水解液的酸度

改變?nèi)芙庖阂掖?∶水 ∶HCl溶液=3∶2∶1（體積比）中HCl的濃度，并分別配置為 1.4、3.0、4.6、6.2 mol/mL的鹽酸溶液，分別溶解黑果枸杞花青素樣品溶液，按1.2.3方法進行液相檢測。

1.2.4.4 水解液的配比

將乙醇∶水∶HCl溶液（3 mol/L）按體積比分別配置為 3∶2∶1、5∶2∶1、2∶3∶1、2∶5∶1，按 1.2.3方法進行液相檢測。

1.2.5 HPLC-MS條件

1.2.5.1 液相條件

色譜系統(tǒng)：Dionex Ultimate 3000 RSLC；色譜柱：Hypersil GOLD aQ，100 mm×2.1 mm，1.9 μm；流動相：A：0.9%乙酸水溶液；B：0.9%乙酸乙腈；進樣量：3 μL；流速：0.3 μL/min。

洗脫梯度：0～15min，97%～85%，A%；15 min～25 min，85%～70%，A%；25 min～30 min，70%～65%，A%；30 min～35 min，65%～10%，A%；35 min～40 min，10%～97%，A%。

1.2.5.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜系統(tǒng)：Thermo Q-Exactive。

質(zhì)譜參數(shù)：噴霧電壓：3.5 kV；護套氣體流量：35；輔助氣體流量：10；毛細管溫度：300℃；加熱溫度：300℃；掃描模式：全掃描（分辨率70000）；掃描范圍：m/z 100～1500。

1.2.5.3 HPLC-MS樣品前處理

精確稱取黑果枸杞花青素樣品1 mg，用pH值為2.0的水解液[乙醇 ∶水 ∶HCl溶液=3∶2∶1（體積比）]溶解至10 mL，過0.22 μm的水相濾膜，進行分析[27]。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 HPLC優(yōu)化條件的確定

通過對水解時間、進樣流速、水解液中HCl濃度、水解液配比等因素的研究，經(jīng)優(yōu)化最終確定條件為用體積比為乙醇 ∶水 ∶HCl溶液（3 mol/L）=3∶2∶1的溶解液溶解黑果枸杞花青素粉末，水解1 h，流速為0.7 mL/min時，獲得的峰型較好。

2.2 花青素標準曲線的建立

花青素標準方程見表1，在1 μg/mL～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好。

表1 6種主要花青素標準方程及線性范圍Table 1 Standard equations and linear range of six main anthocyanins

2.3 黑果枸杞花青素的類型及含量

黑果枸杞花青素樣品最佳條件色譜圖見圖1。通過計算確定黑果枸杞中含有飛燕草素2.32 μg/mL、矢車菊素15.44 μg/mL、矮牽牛素35.18 μg/mL、錦葵素2.63 μg/mL。

2.4 黑果枸杞花青素HPLC-MS檢測結(jié)果

黑果枸杞中花色苷組分及推測結(jié)構(gòu)見表2。

圖1 黑果枸杞花青素樣品最佳條件色譜圖Fig.1 The liquid chromatographic diagram of anthocyanins sample of Lycium ruthenicum Murr.

通過HPLC-MS進行分析，其中分子離子質(zhì)荷比為317是矮牽牛素，m/z 303是飛燕草素，m/z 287是矢車菊素，m/z 331是錦葵素，m/z 301是芍藥素，由于糖基不穩(wěn)定容易裂解，因此會形成離子碎片，所以只能根據(jù)丟失的碎片離子質(zhì)量進行判斷，一般半乳糖苷和葡萄糖苷失去一分子水的分子量為162，分子量為324則是槐糖失去一分子水，而對香豆酸失去一分子水的分子量為146，206是芥子酸失去一分子水的分子量，180是咖啡酸的分子量，由于花青素被葡萄糖糖基化的情況較多，因此對黑果枸杞花青素結(jié)構(gòu)的推測如下：

表2 黑果枸杞中花色苷組分及推測結(jié)構(gòu)Table 2 The composition and speculated structure of anthocyanins in Lycium ruthenicum Murr.

峰1：分子離子峰m/z 479.12，碎片離子317.06[M-162]+，因此推測為矮牽牛素-3-葡萄糖苷或矮牽牛素-3-半乳糖苷，但從文獻可知黑枸杞與葡萄糖苷連接情況較多，因此確定為矮牽牛素-3-葡萄糖苷。

峰2：分子離子峰m/z 773.21，碎片離子m/z 627[M-146]+，m/z 611[M-146-16]+，m/z 465[M-146-16-146]+，m/z 303[M-146-16-146-162]+，推測為是被對香豆酸酰化的含有半乳糖苷或葡萄糖苷的飛燕草素衍生物，結(jié)合文獻初步判定為飛燕草素-3-對香豆酸-葡萄糖苷[9]。

峰3：分子離子峰m/z 757.22，碎片離子 611[M-146]+，m/z 595[M-146-16]+，16 為氧原子的分子量，m/z 449[M-146-16-146]+，m/z 287.05[M-146-16-146-162]+，因此推測是被對香豆酸酰化的含有半乳糖或葡萄糖的矢車菊素衍生物，結(jié)合文獻初步判定為矢車菊素-3-對香豆酸-葡萄糖苷[9]。

峰4：分子離子峰m/z 1095.32，碎片離子479[M-324-146-146]+，m/z 317[M-324-146-146-162]+，推測是被對香豆酸酰化的含有槐糖苷和半乳糖或葡萄糖的矮牽牛素衍生物，結(jié)合文獻可能是矮牽牛素-3-對香豆酸-槐糖苷-5-葡萄糖苷[6]。

峰5：分子離子峰m/z 757.22，m/z 611[M-162-16]+，16 為氧原子分子量，m/z 465[M-162-16-16]+，m/z 449[M-162-16-16-16]+，m/z 303[M-162-16-16-16-162+16]+，因此可推測為是含葡萄糖或半乳糖的飛燕草素衍生物，結(jié)合文獻初步判斷是飛燕草素-3，5-二葡萄糖苷。

峰6：分子離子峰m/z 949.26，碎片離子峰479[M-324-146]+，m/z 317[M-324-146-162]+，峰4與峰6共享某些碎片離子，但從分子量上來看峰4含有兩個對香豆酸酰基，峰6是被對香豆酸酰化的含有槐糖苷和半乳糖或葡萄糖的矮牽牛素衍生物，結(jié)合相關(guān)文獻初步判定為矮牽牛素-3-對香豆酸-槐糖苷-5-葡萄糖苷[6，9]。

峰7：分子離子峰m/z 919.25，碎片離子峰757[M-162]，m/z 465[M-162-292]，292 是兩分子的對香豆酸脫去兩分子水而成的分子量，m/z 303[M-162-292-162]+，推測是被對香豆酸酰化的含有半乳糖苷或葡萄糖苷的飛燕草素衍生物，結(jié)合文獻判斷為飛燕草素-3-對香豆酸-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷[9，15]。

峰8：分子離子峰m/z 611.16，碎片離子峰465[M-146]+，其中146是對香豆酸脫去一份子水的分子量，m/z 449[M-146-16]+，16 為氧原子分子量，m/z 303[M-146-16-146]+，推測為被對香豆酸酰化的飛燕草素衍生物。

峰9：分子離子峰m/z 933.27，碎片離子峰771[M-162]+，m/z 479[M-162-146-146]+，m/z 317[M-162-146-146-162]+，推測為被對香豆酸酰化的含有半乳糖苷或葡萄糖苷的矮牽牛素衍生物，結(jié)合文獻判斷為矮牽牛素-3-對香豆酸-葡萄糖苷-5-葡萄糖苷[15]。

峰10：分子離子峰m/z 947.28，碎片離子峰785[M-162]+，m/z 433[M-162-16]+，m/z 287[M-162-16-146]+，推測為被對香豆酸酰化的含有半乳糖苷或葡萄糖苷的錦葵素衍生物，結(jié)合文獻判斷為錦葵素-3-對香豆酸-葡萄糖苷[9]。

峰11：分子離子峰m/z 595.17，碎片離子峰449[M-146]+，m/z 433[M-146-16]+，m/z 287[M-146-16-146]+，推測為被對香豆酸酰化的矢車菊素衍生物。

峰12：分子離子峰m/z 301.07，無其他碎片離子峰，屬于芍藥素。

峰13：分子離子峰m/z 625.18，碎片離子峰479[M-146]+，m/z 317[M-146-162]+，推測為被對香豆酸酰化的含有葡萄糖或半乳糖的矮牽牛素衍生物，結(jié)合文獻判斷為矮牽牛素-3-對香豆酸-葡萄糖苷[28-29]。

峰14：分子離子峰m/z 771.21，碎片離子峰479[M-146-146]+，m/z 317[M-146-146-162]+，峰14與峰13共享碎片離子，但峰14比峰13多一個對香豆酰基，推測為被對香豆酸酰化的含有葡萄糖或半乳糖的矮牽牛素衍生物，結(jié)合文獻判斷為矮牽牛素-3，5-對香豆酰-葡萄糖苷。

3 結(jié)論

通過試驗確定了高效液相色譜法的最佳檢測條件，確定了黑果枸杞花青素的含量；并檢測出了14種花色苷成分，由于黑果枸杞生長地域不同所含花青素的種類以及含有的糖苷鍵也是不同的，因此要確定黑果枸杞中所含的花青素結(jié)構(gòu)還需進一步研究。

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