基于假單胞菌生長模型預測冷卻豬肉的貨架期

王京，張明贊

（貴州工業職業技術學院，貴州貴陽550025）

豬肉含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物、鈣、鐵、磷等成分，具有補虛強身、滋陰潤燥及豐肌澤膚的作用，是我國和國外日常生活主要的肉類食品之一[1]。冷卻豬肉又稱冷鮮豬肉，是豬肉宰后使胴體深沉溫度在24 h內降至0℃～4℃，并保持在該溫度下貯藏的一類肉品。冷卻豬肉口感細膩，鮮美，具有很高的營養價值，代表了豬肉產業的消費和生產發展方向[2]。但是如何有效抑制冷卻豬肉在生產、運輸和貯藏過程中微生物的生長繁殖過程，防止產品的腐敗變質，一直困擾著生產者。目前常使用微生物預測來快速評估冷藏豬肉的貨架壽命和安全性，極少使用傳統的分析測試。冷卻豬肉具有較強的水分活性和豐富的營養，使得微生物成為肉類腐敗的主要原因。在低溫貯藏條件下，假單胞菌是肉類的主要腐敗物之一，嚴重影響豬肉品質[3]。因此，越來越多的消費者更加關注在預測冷卻豬肉貨架期方面的研究。

通過大量對引起冷卻豬肉腐敗變質因素的研究，國內外學者得出其主要影響因素是假單胞菌和肉類的儲存溫度。假單胞菌是能引起冷卻肉類腐敗變質的主要微生物之一[4-5]，假單胞菌屬占肉類腐敗微生物的25%～26%，是需氧菌，在有氧條件下生長，具有致腐的特性。田璐等[6]指出，在有氧條件下需氧型假單胞菌大量繁殖引起冷卻肉腐敗，繁殖能力與假單胞菌有較強的利用肌氨酸的能力有關[7]。假單胞菌的生長需要足夠碳源與能源，在適宜的條件下，假單胞菌生長達到一定數量時，冷卻豬肉中碳源不能滿足其生長生理的需求，隨后假單胞菌就會利用冷卻豬肉的氨基酸作為生長營養基質，肉類的氨基酸分解利用將會產生一些帶有異味的物質，如含硫化合物、酯、酸等。實際上，肉類的腐敗及貨架期壽命主要取決于肉類中假單胞菌的生理行為，表現在假單胞菌新陳代謝產物的利用或是吸收的大幅度正面或是負面的影響[8]。貯藏所處環境溫度也是影響冷卻豬肉貨架期長短的重要因素[9-10]，由于國內外冷鏈系統不完善，肉類儲運管理不當，尤其是冷凍豬肉庫存和溫度波動較大。在實際冷藏儲存和銷售過程中，溫度高，豬肉中的微生物迅速繁殖，影響豬肉產品的安全。

從現有的研究來看，通過預測變溫條件下微生物的生長，對肉的保質期研究知之甚少，冷卻豬肉的保質期還處于起步階段。因此，在對微生物生長繁殖進行試驗分析的基礎上，建立了豬肉微生物冷卻不同溫度的預測模型，研究腐敗豬肉的微生物生長情況，為評價和控制肉品質量提供理論依據。

1 材料與方法

建立冷卻豬肉貨架期預測模型，以此來證實假單胞菌為變溫條件下冷卻豬肉的特定腐敗菌[11-13]，將冷卻豬肉分別置于 0、5、10、15、20、25 ℃條件下，進行假單胞菌活菌與菌落總數計數，并測定假單胞菌數量、揮發性鹽基氮值、色差L*值及感官評定分值等品質指標。

1.1 材料與儀器

根據GB/T 22289-2008《冷卻豬肉加工技術要求》，每次隨機選取10條常規屠宰分割的豬臀肉，冷藏（0～4℃）條件下2 h內帶回實驗室。

假單胞菌培養基：蛋白胨16.0 g；水解酪蛋白10.0 g；無水硫酸鉀10.0 g；氯化鎂1.4 g；甘油10.0 mL；假單胞菌培養基選擇劑C-F-C（OXOID，英國）1支/200 mL；培養基的pH值調節為7.0±0.2；蒸餾水1000 mL。

平板計數培養基（plate count agar，PCA）：胰蛋白胨5.0 g；酵母浸粉2.5 g；葡萄糖瓊脂15.0 g；蒸餾水1000 mL；pH 7.0±0.2。

SPX-400型智能型生化培養箱：上海科恒實業發展有限公司；JM-A2002電子天平：余姚記銘稱量股份有限公司；SW-CJ-10超凈工作臺：蘇州凈化有限公司；BCD-278TAJ低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；pH S-3C pH計、JM-AI5002便攜式色差儀：余姚市紅銘稱重校驗設備公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離與篩選、樣品處理

菌種分離與篩選：稱取5.0 g冷卻豬肉，加入到50 mL無菌生理鹽水中，再加入4顆小玻璃珠，37℃、180 r/min振蕩培養30 min，吸取5 mL振蕩后溶液加入富集培養基（250 mL三角瓶裝液量為50 mL）中，37℃、180 r/min搖床富集培養24 h。取0.2 mL稀釋適當梯度的富集懸浮液涂布于酪蛋白平板培養基上，靜置5 min后，倒置平板放于37℃培養箱培養24 h。將形成單一菌落，劃線純化后劃Z形線保藏于斜面培養基上，37℃條件下培養1 d或2 d直到斜面出現豐滿的菌落后，放于4℃冰箱保藏，菌株編號為JXJ。

利用傳統的菌種鑒定方法如菌落特征、形態特征、生理生化特征[17]和16S rRNA、recA基因序列分析對菌種進行準確的分類鑒定，采用MEGA5.0生物學軟件構建系統進化樹，采用鄰近相連算法（Neighborjoining）對該菌株的16S rRNA序列進行分析，在樹枝上標記重復1000次，自展檢驗Bootstrap值，從而確定菌株的親緣關系和分類地位[18]。

樣品處理：從貴陽市花溪區星力超市采樣，每次隨機選取10條常規屠宰分割的豬臀肉，冷藏（0℃～4℃）條件下2 h內帶回實驗室。將豬臀肉于超凈工作臺分割成50 g左右大小，懸浮于80℃無菌水中10 s進行滅菌。經培養計數，菌落總數＜102（CFU/mL），滅菌效果較好。菌懸液經適當稀釋，將滅菌后肉樣浸入菌懸液中20 s接種。使接種后肉樣初始接種量為103CFU/g，接種后瀝干菌液于無菌密封袋中，分別置于0、5、10、15、20、25℃低溫恒溫水浴槽中貯藏，溫度波動±0.1℃。

1.2.2 指標的測定

菌落總數、假單胞菌數的測定：在無菌操作環境下，每隔相應時間段取每組樣品（3個肉樣組成）相應肉樣25 g置于錐形瓶中，加入225 mL無菌生理鹽水中并密封好，用搖床搖1 h左右，然后按10倍稀釋梯度，每個稀釋度取100 μL樣液涂布于培養基表面，共取3個稀釋度，每個稀釋度做3個重復，進行假單胞菌數的測定，細菌總數的測定按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》進行。

揮發性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）的測定：在規定的時間段，取豬肉樣10 g絞碎攪勻，置于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水備用。按GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》微量擴散法測定揮發性鹽基氮含量。

色差的測定：每隔相應時間取相應肉樣用便攜式色差儀測色差L*值，每個樣品至少測定3次，取平均值。

感官評定：10位專家組成感官評價小組，對肉的氣味，顏色，黏度，質地，肉湯進行綜合評價。使用相對簡單的7分制，得分1表示最好的豬肉質量，得分7表示腐敗豬肉，這是可接受的界限，當評分人數半數以上的評價或以上時，即為感官拒絕點，評定方法按GB/T 22289-2008《冷卻豬肉加工技術要求》執行。

pH值的測定：每隔相應時間取豬肉樣品10 g絞碎攪勻，放于盛有100 mL滅菌后蒸餾水的錐形瓶中，搖床振蕩靜置30 min后過濾，測定濾液的pH值。濾液用于TVB-N的測定。

1.2.3 數據處理與統計分析

本試驗數據采用SPSS 20.0，OriginPro9.0軟件進行分析，各指標數據采用SPSS 20.0統計軟件進行相關分析和聚類分析，采用OriginPro9.0，Matlab7.0軟件進行模型擬合和回歸分析。

2 試驗結果與分析

2.1 菌落與細胞形態

菌株JXJ的平板菌落形態如圖1。

圖1 菌株JXJ的平板菌落形態Fig.1 Colonies of the JXJ on bacterial medium

在假單胞菌培養基上菌落生長較快，菌落特征明顯，呈淡黃色半透明，近圓形，邊緣齊整，光滑稍隆起，菌落直徑1.5 mm～3.0 mm，其生理生化特征見表1。

表1 JXJ生理生化特征—碳源利用Table 1 Physiological and biochemical characteristics（utilization of carbon sources）of the strain JXJ

經軟件比對該株菌株與熒光假單胞菌（P.fluorescens）特征接近。根據以上形態及生理生化特征可知菌株JXJ的特征符合假單胞桿菌屬，初步鑒定它屬假單胞菌屬（Pseudomonas）。

將JXJ菌株的全部16S rRNA序列分別提交到NCBI，通過Blast在線程序在GenBank數據庫中檢索與已刊登的16S rRNA序列同源性進行比較，下載同源性較高的菌株的序列，采用軟件MEGA 5.0對其進行分析，采用鄰近法構建系統樹，并且Bootstrap1000次檢驗分子系統樹置信度獲得系統發育樹（見圖2）。

由系統發育樹可知，菌株JXJ形態特征和生理生化特征接近熒光假單胞菌屬，菌株JXJ的16S rRNA序列與Pseudomonas sp.HY13KR序列同源性在99%以上，可進一步說明菌株JXJ為假單胞菌屬。

2.2 假單胞菌與各品質指標的相關性分析

冷卻豬肉在4℃貯藏下各品質指標的皮爾遜相關系數見表2。表2所示的結果，豬肉在4℃貯藏期間，假單胞菌數量與色差L*值、感官評價分值、菌落總數、pH值及揮發性鹽基氮（TVB-N）的相關系數分別為-0.897（p＜0.01）、0.984（p＜0.01）、0.987（p＜0.01）、0.723（p＜0.01）、0.885（p＜0.01），差異均極顯著（p＜0.01），兩兩高度相關。

圖2 基于JXJ的部分16S rRNA序列同源性構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree on the similarity of partial 16S rRNA sequence of the strain JXJ

表2 冷卻豬肉在4℃貯藏下各品質指標的皮爾遜相關系數Table 2 Pearson correlation coefficient of quality characteristics of chilled prok stored at 4℃

從表2可知，假單胞菌的生長與豬肉在4℃貯藏期間的細菌總數、TVB-N及色差L*值等多種品質指標均顯著相關，并且假單胞菌菌落總數與腐敗指數之間的相關系數大于其他指標的相關系數，從而確定屬于冷凍豬肉的假單胞菌的特征，利用生長模型預測好氧貯藏條件下冷凍豬肉腐敗程度。

2.3 假單胞菌的腐敗限控量的確定

為確定豬肉中假單胞菌的腐敗限量，選用假單胞菌總數、細菌總數、TVB-N值、色差L*值及感官評定值作為冷卻豬肉不可接受的判斷指標，通過SPSS 20.0統計軟件對各測定指標數據進行分析及Origin－Pro9.0軟件進行聚類分析，則可得表3及圖4所示的結果。

表3 4℃貯藏冷卻豬肉各品質指標（平均值+標準差）Table 3 Quality characteristics of chilled pork stored at 4 ℃（Mean±SD）

由表3可看出：假單胞菌的數量和菌落總數隨時間增加，假單胞菌的生長在第8天顯著增加為假單胞菌生長的延滯期和對數生長期，8天之后基本處于穩定期；隨著貯藏時間的變化，豬肉的pH值緩慢增加，可看出在貯藏第8天時pH值達到6.30；TVB-N值在貯藏的前8天變化不大，基本保持在7 mg/100 g左右，但到了第10天數值升至16.87 mg/100 g，超過GB2707-2016《食品安全國家標準鮮（凍）畜、禽產品》鮮（凍）肉中TVB-N值≤15 mg/100 g的標準，與前8天的數值差異顯著（p＜0.05）；色差L*值描述肉的亮暗程度，貯藏初期肉的顏色變化不是很大，基本處于39左右，但是到了8天之后顏色亮度值直線下降，第10天的數值與前8天差異顯著（p＜0.05）；感官評定值在第10天接近4.5分，已為不可接受值，表明此時的肉已經明顯腐敗。聚類分析見圖3。

圖3 聚類分析Fig.3 Cluster analysis

由圖3可明顯得出：根據貯藏時間的分類，將產品的前8天分成一個類別，聚類成一個類別，加上細菌總數，即可確定感官評定前8天前的TVB-N值的產品是可以接受的產品，不可接受的產品。由于假單胞菌與各種腐敗指標之間的相關性非常顯著，由冷凍豬肉腐敗控制的 6.55 lg（CFU/g）（3.6×106CFU/g）超過此值可判定為腐敗，這與劉婷婷等[24]所得假單胞菌達107CFU/g～109CFU/g牛肉貨架期終點的結論是相接近的。

3 模型的建立與驗證

3.1 假單胞菌生長動力學模型的建立（一、二級模型）

一級模型主要預測恒定環境條件下（如環境溫度、pH值等）微生物的生長情況[19]。一般微生物生長曲線由滯后期，對數期，穩定期和衰減期四部分組成（未顯示）。在微生物生長過程中，環境因素，不同生長階段的肉類和微生物等營養物質對微生物的生長具有重要影響。近年來，常用的一級模型主要包括線型模型、Gompertz模型[20]等。微生物生長曲線的示意圖見圖4。

圖4 微生物生長曲線的示意圖Fig.4 Schematic depiction of a microbial growth curve

分別將在 0、5、10、15、20、25 ℃條件下，測量假單胞菌的數據，用Gompertz方程[21]式（1）描述不同溫度條件下假單胞菌的生長動態。

式中：Nt為 t時刻微生物數量，lg（CFU/g）；N0為初始時微生物數量，lg（CFU/g）；Nmax為穩定期時微生物的最大數量，lg（CFU/g）；μm為微生物生長的最大比生長速率，h-1；t為貯藏時間，h，tb微生物生長延遲期的時間，h。

微生物生長預測二級模型方程的使用和研究都比較廣泛，描述不同溫度對微生物生長的影響動力學模型常用Belehradek方程來描述，其方程為

式中：μm是一級模型求出的生長速率，h-1；λ是模型待求的參數，h1/2/℃；Tmin是理論上的最小生長溫度，K，是微生物生長的特征溫度，K；tb是微生物生長延遲期的時間，h。

3.2 假單胞菌生長模型的可靠性評價和驗證

通過建立的微生物生長預測模型可求得在5℃和15℃貯藏時假單胞菌數的預測值與實際檢測的假單胞生長數進行比較，采用偏差度Bf及準確度Af兩個指標來評價己經建立的特定腐敗微生物生長動力學模型的可靠性[22]。

式（3）、（4）中：Nact是試驗實際測得的微生物數量，lg（CFU/g）；Npre是應用微生物生長動力學模型的與同一時間的微生物數量，lg（CFU/g）；n是試驗次數。

冷卻豬肉貨架期[23]（shelf life，SL），根據所建立的特定腐敗微生物生長預測模型，可通過該特定腐敗菌量從（N0）增值到（Ns）所需要的經歷時間來進行預測。

根據所建立的冷卻豬肉的SL方程，隨機取貯藏在5℃和15℃溫度條件下的冷卻豬肉，測量方程中的指標算出預測值，與實際冷卻豬肉的貨架期進行比較，評價所建立貨架期預測模型的可靠性及使用性。

3.3 假單胞菌生長的動力學模型（一級模型擬合）

在變溫條件下，根據測定假單胞菌活菌數的結果，采用Matlab7.0軟件進行模型擬合和回歸分析。

擬合不同的一級模型，繪制了在不同溫度條件下的時間-假單胞菌總數曲線，得到在不同溫度條件下的生長曲線，相應的Gompertz擬合方程為：

在 0、5、10、15、20、25 ℃有氧貯藏條件下冷卻豬肉中利用Gompertz方程擬合的假單胞菌生長曲線見圖5。

圖5 在0、5、10、15、20、25℃有氧貯藏條件下冷卻豬肉中利用Gompertz方程擬合的假單胞菌生長曲線Fig.5 Growth data and fitted modified Gompertz curves of Pseudomonads spp.on chilled pork stored aerobically at 0、5、10、15、20 and 25℃

從圖5中可以看出，Gompertz模型方程很好地擬合了假單胞菌在不同溫度下的生長情況，生長曲線呈S型，溫度對微生物生長有顯著影響，隨著溫度達到最高菌數逐漸降低，最高0℃約250 h，最低25℃僅約50 h。

常溫（變溫）貯藏下初始霉菌數（N0）、最大菌數（Nmax）、最大生長速率 μm、延遲時間 tb、均方誤差（meansquare error，MSE）和 R2見表4。

表4 常溫（變溫）貯藏下初始霉菌數（N0）、最大菌數（Nmax）、最大生長速率、延遲時間、MSE和R2Table 4 The initial number of molds N0，the maximum number of bacteria（Nmax），the maximum growth rate，the delay time，the MSE and the R2at the normal temperature（temperature）storage

由表4可以看出溫度對假單胞菌生長的影響，Gompertz方程擬合的接種初始菌數在3.62 lg（CFU/g）～3.88 lg（CFU/g），最大菌數集中在 7.50 lg（CFU/g）。最大比生長速率隨溫度的升高而升高，延遲期的時間隨溫度的升高而減少。可以看出模型擬合的MSE、R2并沒有成良好的規律性，R2均大于0.95且MSE較小，說明兩者均擬合得很好，表明Gompertz方程能很好的應用于對假單胞菌的預測。

3.4 假單胞菌生長的動力學模型（二級模型擬合）

根據求得的假單胞菌在不同溫度下的最大比生長速率，利用OriginPro9.0統計軟件擬合最大比生長速率－溫度（μm1/2-T），見圖6，得到二級模型，μm1/2=0.134+0.010T（p＜0.01，R2=0.964），即：μm1/2=0.010[T-（-13.4）]。由二級模型 μm1/2=λ（T－Tmin），可知假單胞菌的λ=0.010℃·h1/2，假單胞菌延滯時間的擬合結果為：tb-1/2=0.0650+0.0242T。

圖6 假單胞菌的生長速率與溫度的擬合關系Fig.6 Growth rate and temperature of the fitting relationship about Pseudomonas sp.

表5列出了溫度與比生長速率平方根模型的殘差值。

表5 溫度與比生長速率平方根模型的殘差值Table 5 Residual value of temperature and specific growth rate square root model

可以看出，其殘差的絕對值均小于0.05，說明擬合的模型關系比較合理，說明假單胞生長的平方根預測模型能較好的描述變溫條件下對假單胞菌生長的影響。

3.5 模型的驗證

表6顯示了在5℃和15℃下的預測值和實際所得貯藏過程的真實值來計算所得的預測方程的偏差度（Bf）和準確度（Af）。

表6 冷卻豬肉在5℃和15℃貯藏時微生物數量預測值的偏差度和準確度Table 6 The deviation and accuracy of the predictions of the number of microbes when the pork was stored at 5℃and 15℃

由表6可知，預測值上下波動的幅度為10%左右，預測值和實測值之間的差異即Af介于15%以內，表示誤差比較低，建立的數學模型能很好的預測特定腐敗微生物在5℃和15℃下的生長動態。

3.6 貨架期預測模型的確立

根據建立的假單胞菌生長預測模型，可以用假單胞菌這一特定腐敗菌從初始菌數（N0）增殖到最小腐敗量（Ns）所需的時間來預測0～25℃有氧貯藏豬肉的剩余貨架期。得知冷卻豬肉的最大腐敗假單胞菌數為 6.55 lgCFU/g（3.6×106CFU/g）；最大菌落總數約為7.50 lg（CFU/g）。因此，只要實時測量冷卻豬肉的初始假單胞菌總數，就可以預測在0～25℃有氧貯藏豬肉的剩余貨架期，表示如下：

3.7 貨架期預測模型的驗證

將在不同收獲地點隨機購買的新鮮豬肉放置在0、5℃和10℃儲存溫度下，另一組新鮮豬肉儲存在15、20℃和25℃下。相應的肉樣品最初測量并計算假氣單胞菌。隨著儲存時間的延長，新鮮豬肉的保質期根據感官評分進行預測，貨架期模型預測的貨架期與實際鮮豬肉的貨架期如表7所示。

表7 貨架期（SL）的預測值與實際貨架期的壽命比較Table 7 The predicted value of the shelf life（SL）is compared with the actual shelf life

由表7可知，在 0、5、10、15、20、25 ℃有氧貯藏條件下測定冷卻豬肉的貨架期，通過對豬肉剩余貨架期預測值與實際貨架期對比發現偏差都小于1 d，說明所建立的貨架期模型可行性較好，適用價值高。

4 結論

豬肉中的假單胞菌生長和冷藏在菌落總數，TVBN值，L值和各項質量指標的感官評價方面均顯著（p＜0.01），所以可以判斷冷卻豬肉具體腐敗菌為假單胞菌。結果表明，通過聚類分析假單胞菌的冷凍豬肉腐敗控制的可行性和可行性以及控制體積為6.55lg CFU/g（3.6×106CFU/g）來確定腐敗程度，從而驗證了假單胞菌疾病預測模型。冷凍豬肉在低溫儲存下的生長通過假單胞菌屬的一階和二階模型擬合來評估。在儲存條件 0、5、10、15、20、25 ℃下通過 Gompertz方程測定冷凍豬肉的保質期。預測結果偏離實際儲存結果不到一天，表明所建議的保質期模型更加可行，為在變溫條件下實時獲得冷凍豬肉的剩余保質期奠定了基礎。建立的假單胞菌生長動力學模型能快速可靠地預測惡臭假單胞菌的動態生長，為假單胞菌的預測和監測提供了有效工具，有效延長冷卻豬肉貨架期，保持肉制品風味，保障人類食用健康。

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