高壓均質對大豆蛋白柔性和乳化性的影響及相關性分析

王喜波 徐曄曄 于 潔 王 健 王小丹 江連洲

(東北農業(yè)大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(SPI)由于其高度的營養(yǎng)和功能特性而被廣泛應用于許多基于蛋白質的食品配方中[1]。其中SPI柔性指的是當蛋白質所處周圍環(huán)境變化時，其結構能夠發(fā)生改變的能力[2]，通過蛋白酶消化檢測的蛋白質結構柔性可能是控制乳化特性的重要結構因素[3]。TANG等[4]通過S-S裂解研究了牛血清白蛋白的構象柔性和乳化性質，發(fā)現(xiàn)蛋白質(在溶液中)的構象柔性在其乳化特性的不同方面起著至關重要的作用。高壓均質是在制藥、食品和化妝品領域研究中被廣泛應用的一種非熱技術，需要高能量輸入來制備液滴尺寸在亞微米范圍內的乳液，一般通過高剪切攪拌、高壓均質機或超聲波引發(fā)器獲得[5]。在均質化過程中，流體受到空穴爆炸力、湍流、剪切、摩擦、熱、壓縮、加速、快速壓降和碰撞等各種力的同時作用而形成一種精細的、均勻的乳液[6]。近年來對于高壓均質對蛋白結構和功能性質之間構效關系的研究已經獲得了廣泛的關注，然而，關于高壓均質對SPI柔性的影響及柔性與乳化特性相關性關系分析還鮮有報道。

本文將柔性的概念引入高壓均質改性中，研究均質壓力對SPI柔性、乳化特性以及其他結構特性的影響，并分析SPI柔性與乳化特性之間的關系，以期為實際生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，由東北農業(yè)大學大豆研究所提供；大豆油，九三集團哈爾濱惠康食品有限公司；三氯乙酸，永華精細化學品有限公司；SDS(十二烷基硫酸鈉)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、胰蛋白酶、ANS熒光探針，Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T18 Basic型高速分散機/勻漿機，德國IKA公司；LD4-2A型低速離心機，北京醫(yī)用離心機廠；實驗型高壓均質機，英國Stansted Fluid Power公司；TU-1800型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機，德國Christ公司；ALC-310.3型分析天平，德國艾科勒ACCULAB公司；紫外分光光度計，美國布魯克海文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1SPI制備

根據SORGENTINI等[7]的方法略作修改，大豆經粉碎機粉碎并過60目篩，再經索氏提取器用乙醚提取后獲得脫脂豆粕。將脫脂豆粕與蒸餾水以料液比10 mg/L的比例混合。用2 mol/L NaOH調體系pH值為8.5，室溫(20℃)低速攪拌2 h。離心(4 000g)20 min，取上清液，用2 mol/L HCl調pH值至4.5，4℃靜置12 h，取沉淀進行離心(4 000g，5 min)，沉淀水洗兩次，復溶后調pH值至7.0，預凍后進行冷凍干燥。

1.3.2SPI成分測定

蛋白含量測定采用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)；含水率測定采用直接干燥法(GB 5009.3—2010)；灰分含量測定參照GB 5009.4—2010；粗脂肪測定參照GB/T 14772—2008。

1.3.3樣品制備

將SPI溶于緩沖液(0.2 mol/L、pH值7.0磷酸鹽緩沖液)，質量濃度為5 mg/mL，室溫攪拌2 h，再使用T18 Basic型高速分散機處理1 min，轉速為10 800 r/min，然后在4℃靜置水化12 h。

1.3.4高壓均質處理

將制備好的樣品取出攪拌均勻至室溫，用高壓均質機處理，設定均勻壓力分別為0、40、60、80、100、120、140、160、180、200 MPa。

1.3.5柔性測定

參照KATO等[8]的方法略作修改。利用SPI對胰蛋白酶的敏感性來表征柔性。取250 μL 1 mg/mL酶液(0.05 mol/L、pH值8.0 Tris-HCl緩沖液)加入到4 mL 1 mg/mL處理后SPI蛋白溶液中(蛋白與酶質量比為16∶1)，38℃保溫酶解5 min，酶解反應結束后，加4 mL 5% TCA(三氯乙酸)終止反應，離心后取上清液測定其在280 nm吸光度，用吸光度A表征量化柔性。

1.3.6表面疏水性測定

參照SCHMAL等[9]方法并略作改動。用濃度0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值 7.0)將SPI樣品溶液稀釋到2 mg/mL，再稀釋為樣品質量濃度分別為0.1、0.05、0.002 5、0.001 25 mg/mL，加入20 μL的ANS(8 mmol/L ANS，溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值7.0)熒光探針，混勻后在室溫下避光15 min后測定SPI樣品的熒光強度，同時設定激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，測得的熒光強度對蛋白溶液質量濃度作圖，選擇線性關系良好的回歸線斜率作為蛋白質表面疏水性指數。

1.3.7濁度測定

參照KURGANOV[10]的方法并略作改動。將處理后的SPI樣品溶液稀釋至3 mg/mL，混合均勻后在波長400 nm測定其吸光度，用所得光密度(OD值)表示濁度，所有測定結果重復3次。

1.3.8粒徑測定

將處理過的SPI樣品用去離子水稀釋到1 mg/mL，在粒度測定儀上進行粒度的測定，每個蛋白樣品檢測3次。

1.3.9內源性色氨酸熒光光譜測定

參照LIU等[11]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋到0.2 mg/mL進行測定，同時設定激發(fā)波長為290 nm，發(fā)射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm，電壓為700 mV進行熒光光譜掃描，所有測定結果重復3次。

1.3.10紫外掃描

參照LIANG等[12]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋至0.2 mg/mL后進行紫外掃描，掃描波長范圍150～500 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率為0.2 nm，所有測定結果重復3次。

針對實例2，教師提出問題：將幼小植株在適宜條件下橫放，一段時間以后，莖彎曲向上生長，根彎曲向下生長（圖5）。一般認為，這是因為重力作用使得生長素分布不均勻，而且與根、莖對生長素的敏感程度不同有關，你能對這種現(xiàn)象作出合理解釋嗎？

1.3.11乳化性測定

參照TANG等[13]的方法。將處理后的SPI蛋白樣品稀釋到2 mg/mL，處理后蛋白樣品與大豆油以體積比3∶1混合，分散機10 000 r/min處理1 min，迅速吸取底部乳液50 μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，在漩渦混合器上混合均勻。分別測定0 min和10 min時吸光度，乳化活性用吸光度A表示，乳化穩(wěn)定性的計算公式為

式中E——乳化穩(wěn)定性，min

A0——0 min時測得的吸光度

A10——10 min時測得的吸光度

1.3.12數據統(tǒng)計分析

每次試驗做3次平行，結果用平均值±標準差表示，數據間差異顯著性采用SPSS 17.0進行數據統(tǒng)計分析，試驗數據用Origin 9.0繪制。

2 結果與分析

2.1 大豆分離蛋白的組成

試驗制得的SPI蛋白質量分數、含水率、灰分質量分數和粗脂肪質量分數分別為(90.22±0.44)%、(3.24±0.67)%、(3.39±0.53)%和(0.47±0.56)%，符合試驗要求[14]。

2.2 均質壓力對SPI柔性的影響

在不同均質壓力處理條件下，SPI柔性隨著均質壓力的增大而呈現(xiàn)增大的趨勢，在均質壓力范圍為0～160 MPa時，SPI柔性隨著均質壓力的增大而增大，180 MPa時，柔性變化趨勢不明顯，這是因為高壓均質產生了強大剪切力、撞擊力及空穴爆炸力，均質壓力處理對SPI的三級和四級結構有顯著的影響，并通過非共價鍵的切割破壞了SPI蛋白內部的剛性結構[15-16]，導致柔性的上升，且隨著均質壓力的上升，破壞強度增大。當均質壓力為200 MPa時，SPI柔性表現(xiàn)出下降的趨勢，這可能是由于通過SH/S-S交換連接形成分子間二硫鍵，壓力過大而引起了蛋白亞基的聚集[17-18]。

2.3 均質壓力對SPI表面疏水性指數的影響

TEDFORD等[15]指出均質壓力使弱氫鍵和分子間作用力之間裂解從而導致蛋白質分子結構的變化。SPI表面疏水性指數隨著均質壓力的增加而上升，表明高壓均質的作用會使SPI蛋白質分子進一步伸展，原來隱藏在SPI內部的疏水基團隨著均質壓力的增加而逐漸暴露于外部，使得SPI結構變得更加伸展。當均質壓力為200 MPa時，SPI表面疏水性指數大幅增加，這可能是因為高壓處理SPI時強剪切力對SPI內部隱藏的疏水性基團進行切割，更多的疏水性基團暴露，SPI表面疏水性指數大幅增加，柔性隨均質壓力變化趨勢與表面疏水性指數隨均質壓力變化的趨勢相近。SPI表面疏水性指數的增加可以增強SPI的乳化活性，這是因為高壓均質處理改善了大豆蛋白質，特別是β-伴大豆球蛋白的β-亞基和大豆球蛋白的酸性亞基吸附在油-水乳液的油/水界面處的能力[19]，因此，SPI表面疏水性指數的增加意味著乳化活性也隨之增強。

2.4 均質壓力對SPI濁度的影響

隨著均質壓力的增加，SPI濁度逐漸降低，這是因為未高壓均質處理的蛋白質在底部沉積有大量高分子聚合物，蛋白質溶液不均勻，故SPI濁度較大。CROMWELL等[20]認為濁度與溶液中聚集體大小和數量有關，當較大的SPI顆粒在高壓均質條件下處理后可以加工成穩(wěn)定的乳液或懸浮液細顆粒，導致溶液濁度的降低，并且均質壓力越大，濁度越低，這可能是由于高壓均質處理產生了更加靈活和低分子量的聚集體，這些聚集體迅速移動到氣-液界面并展開，導致表面張力的有效降低[21]。IBANOLU等[22]在乳清蛋白分離物中也發(fā)現(xiàn)了類似結果，推測蛋白質分子變得更小，更易于在高壓下以更快的速度在界面吸附，形成均勻穩(wěn)定的乳液，即濁度降低。

2.5 均質壓力對SPI粒徑的影響

圖1 均質壓力對SPI粒徑的影響Fig.1 Effect of homogeneous pressure treatment on particle size of SPI

2.6 SPI內源性色氨酸熒光光譜分析

熒光光譜法是一種非常成熟的技術，用于觀察蛋白質構象變化，以及研究蛋白質基質在加工或儲存過程中的變化，在蛋白質中，主要的熒光基團是色氨酸的吲哚基團，其發(fā)射對溶劑極性非常敏感[26-28]。因此，蛋白質的熒光光譜由熒光氨基酸的化學環(huán)境決定，色氨酸(Trp)光譜的變化可以用于鑒定蛋白質的構象變化[29]。如圖2所示，內源性熒光強度隨著均質壓力的增加而增加，這與濁度變化趨勢一致，表明隨著柔性的增加，SPI空間結構發(fā)生變化，色氨酸殘基暴露于蛋白質分子表面，蛋白質的疏水區(qū)域局部改變，發(fā)色基團如色氨酸殘基所處環(huán)境由非極性向極性轉化，這可能是由高壓均質處理導致SPI蛋白分子部分解折疊造成的，即隨著柔性的增加，SPI三級結構變得更加舒展。

圖2 SPI內源性色氨酸熒光光譜分析Fig.2 Analysis of endogenous tryptophan fluorescence of SPI

2.7 SPI紫外掃描光譜分析

蛋白質產生紫外吸收主要是由于蛋白中的發(fā)色基團對紫外光的吸收作用，發(fā)色基團包括色氨酸和酪氨酸殘基側鏈基團，根據對紫外光譜吸收的不同，可以推斷蛋白質分子構象的變化[30]，如圖3所示，隨著均質壓力的增加，紫外吸收下降，說明SPI分子中具有紫外吸收的氨基酸殘基(如酪氨酸殘基等)因均質處理而暴露在蛋白分子的表面，發(fā)色基團所處的環(huán)境由非極性向極性變化，均質處理促使蛋白多肽鏈局部展開，蛋白分子柔性增大。這與濁度變化趨勢一致。這更加印證了內源性色氨酸熒光光譜的結果，隨著蛋白柔性的增加，SPI結構變得更加的舒展。

圖3 SPI紫外圖譜分析Fig.3 Analysis of SPI by ultraviolet scanning spectrometry

2.8 均質壓力對SPI乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響

如圖4所示，當均質壓力不大于160 MPa時，乳化活性隨著均質壓力的增加而增加，這與楊盛楠等[31]的結果一致，即在一定均質壓力范圍內，隨著均質壓力的增大，SPI乳化活性增加，當壓力為160 MPa時乳化活性最大，隨后乳化活性又呈現(xiàn)下降的趨勢，而乳化穩(wěn)定性隨著均質壓力的變化趨勢與乳化活性隨均質壓力的變化趨勢相似，當壓力為180 MPa時乳化穩(wěn)定性最大，這與柔性變化趨勢較相近。SPI柔性增強，原先包含在分子內部的疏水性基團暴露出來，增強了蛋白的親油性，宏觀表現(xiàn)為蛋白乳化能力的提高。

圖4 均質壓力對SPI乳化特性的影響Fig.4 Effect of homogeneous pressure treatment on emulsification properties of SPI注：不同大寫字母表示乳化穩(wěn)定性差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示乳化活性差異顯著(P<0.05)。

2.9 SPI柔性與乳化性的關系

由圖5、6可知，在各高壓均質壓力條件下，隨著柔性的增加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)遞增趨勢，具有良好的線性相關關系，其中，SPI柔性與乳化活性、乳化穩(wěn)定性的線性擬合模型函數分別y=1.485 8x+0.016 9、y=34.062x+3.520 6，相關系數分別為0.893、0.938，當均質壓力為180 MPa時，SPI柔性與乳化穩(wěn)定性可以達到最大，且高壓均質處理對乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響略大于柔性。

圖5 柔性與乳化活性的關系Fig.5 Relationship between flexibility and emulsifying activity of SPI

圖6 柔性與乳化穩(wěn)定性的關系Fig.6 Relationship between flexibility and emulsification stability of SPI

中性大豆蛋白經過高壓均質處理可以提高這些蛋白的乳化活性[32]，形成具有抗絮凝現(xiàn)象和高界面蛋白濃度的油滴乳液[15]，YU等[33]發(fā)現(xiàn)高壓均質處理可以改善貽貝分離蛋白的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。關于柔性和乳化性的關系研究，其中KITTIPHATTANABAWON等[34]認為，蛋白質的乳化性與分子的柔性有關，柔性的增加可以促進蛋白質分子向界面移動，并有助于蛋白分子在界面上發(fā)生重排，王喜波等[35]的研究結果表明，超高壓(100～450 MPa)均質處理條件下，SPI柔性與乳化活性、乳化穩(wěn)定性呈正相關關系。

3 結論

(1)當均質壓力為0～160 MPa時，SPI柔性隨著均質壓力的增加而增加，160～180 MPa時柔性變化不明顯，當均質壓力為180～200 MPa時，SPI柔性又呈現(xiàn)下降的趨勢。

(2)表面疏水性隨著均質壓力的增大而增大，而濁度則隨之減小。乳化特性隨均質壓力的變化趨勢與柔性隨均質壓力的變化趨勢相似，紫外掃描、內源性色氨酸熒光光譜研究發(fā)現(xiàn)，隨著SPI柔性的增加，其結構變得更加舒展。

(3)在不同均質壓力處理條件下，SPI柔性與乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈顯著性正相關關系，相關系數分別為0.893和0.938。

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