桃紅四物湯保護2型糖尿病模型大鼠血管損傷的實驗研究

沈安魯，彭代銀，施 慧， 韓 嵐，戴 榮，王 星

(安徽中醫藥大學 安徽省中醫藥科學院，安徽 合肥 230012)

糖尿病是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷引起的代謝性疾病，其臨床表現不僅以持續性高血糖為特點，并且還有高血糖所帶來的血管并發癥的損害。糖尿病血管并發癥一直備受國內外學者的關注，是糖尿病主要的慢性并發癥，更是影響糖尿病患者生存率的重要因素，已成為中國糖尿病致殘率和致死率最高、危害最大的慢性并發癥[1]。因此，深入研究糖尿病誘發血管病變的發病機制，積極探索有效防治糖尿病血管并發癥的途徑，對降低糖尿病的病死率有重要的意義。本實驗以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)模型大鼠為研究對象，觀察桃紅四物湯對模型大鼠胸主動脈損傷的保護效應及對核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)等炎性因子的干預作用，探討桃紅四物湯防治糖尿病血管并發癥的效應機制，為其臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 實驗藥品 桃紅四物湯提取液：按原方劑量配制桃紅四物湯(白芍、熟地黃各12 g，當歸10 g，桃仁9 g，川芎8 g，紅花6 g)，采用75%乙醇回流提取2次，制成1.8 g/mL提取液，備用；鹽酸吡格列酮(批號 116001)：中美華東制藥有限公司；鏈脲佐菌素(批號 20150121544)：Sigma公司。

1.2 實驗試劑 兔抗鼠NF-κBp65抗體(GR113708-1)：美國Abcam公司；大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)ELISA試劑盒(20160311A)：上海谷研實業有限公司；山羊抗兔IgG/HRP：北京中杉金橋生物技術有限公司；Trizol：Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒：Hermo公司。

1.3 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質量180～220 g，共120只，由安徽醫科大學實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(皖)2011-002]提供。

1.4 主要儀器 全自動酶聯免疫工作站：意大利MAROCHE公司；FCM凝膠成像系統：美國Protein Simple公司；熒光定量PCR儀：美國Thermo公司；LDZ4型微量離心機：北京醫用離心機廠；強生穩步型血糖儀：美國強生公司。

2 方法

2.1 T2DM模型復制及大鼠分組 大鼠正常喂養1周后，除10只作為正常組外，其余各組大鼠予以高糖高脂飼料連續喂養4周，采用鏈脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射以復制T2DM模型，正常組給予檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(10 mL/kg)腹腔注射。1周后采用血糖儀測定血糖值，選取隨機血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作為T2DM模型[2]，將模型大鼠隨機分為5組：模型組，陽性對照組(按文獻[3]給予鹽酸吡格列酮5.3 mg/kg)，桃紅四物湯低劑量(4.5 g/kg，相當于臨床等效劑量1倍)、中劑量(9 g/kg)、高劑量(18 g/kg)組，每組15只，各組按劑量給藥8周。末次給藥后，用3.5%水合氯醛麻醉大鼠，無菌條件下腹主動脈取血，摘取胸主動脈。

2.2 指標檢測

2.2.1 T2DM模型大鼠胸主動脈形態學檢測 4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，采用蘇木精-伊紅(hematoxin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察組織形態學特征。

2.2.2 Western blot法檢測T2DM模型大鼠胸主動脈組織NF-κBp65蛋白表達 稱取組織50 mg，用PBS制備成組織勻漿液，提取總蛋白，電泳，轉膜，室溫下封閉，4 ℃孵育過夜，加二抗孵育，搖床振搖洗膜4次，采用Gelpro32軟件分析組織NF-κBp65蛋白相對表達水平。

2.2.3 RT-qPCR技術檢測T2DM模型大鼠胸主動脈單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)和血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)mRNA表達 稱取組織50 mg，經Trizol抽提總RNA，逆轉錄合成cDNA。大鼠actin引物：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCGTA-3′，下游5′-GACTCATCGTACTCGTGCTTGCTG-3′；MCP-1引物：上游5′-GTCGGCTCGAGAACTCAAGA-3′，下游5′-TGAAGTCCTTAGCGTTGATGC-3′；VCAM-1引物：上游5′-GTCAACTGCACCGTCCCTAAT-3′，下游5′-TTGTGCCAGTTTCCTCCCTTA-3′。按照2-ΔΔCt法計算MCP-1和VCAM-1 mRNA相對表達水平。

2.2.4 ELISA法檢測T2DM模型大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量 采用全自動酶聯免疫工作站，按照試劑盒說明書，計算血清TNF-α、TGF-β1的含量。

3 結果

3.1 桃紅四物湯對T2DM模型大鼠胸主動脈組織形態的影響 模型組大鼠胸主動脈內膜不完整，平滑肌層結構紊亂，有泡沫細胞，并伴有一定程度的平滑肌內移，可見內膜損傷，符合臨床T2DM模型大鼠血管的病理變化[3]，說明模型復制成功。而桃紅四物湯各劑量組藥物干預8周后，大鼠胸主動脈內膜和平滑肌層排列整齊，細胞膜及核膜較為清晰、完整，胞漿染色均勻，說明桃紅四物湯可顯著改善T2DM模型大鼠胸主動脈病理改變。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組

圖1各組大鼠胸主動脈病理形態變化(HE染色，10×20倍)

3.2 桃紅四物湯對T2DM模型大鼠胸主動脈NF-κBp65蛋白表達的影響 T2DM模型大鼠胸主動脈NF-κBp65蛋白表達水平較正常組顯著升高(P<0.05)；桃紅四物湯干預8周后，各劑量組NF-κBp65蛋白表達水平均較模型組顯著下降(P<0.05)；桃紅四物湯對NF-κBp65蛋白表達的抑制作用具有明顯的劑量依賴性。見圖2。

3.3 桃紅四物湯對T2DM模型大鼠胸主動脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和桃紅四物湯高、中、低劑量組大鼠胸主動脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)；桃紅四物湯對T2DM模型大鼠胸主動脈MCP-1 mRNA表達的抑制作用具有一定的劑量依賴性。見圖3。

注：A.正常組；B.模型組；C.陽性對照組；D.桃紅四物湯低劑量組；E.桃紅四物湯中劑量組；F.桃紅四物湯高劑量組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，◇P<0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，□P<0.05

圖2桃紅四物湯對T2DM大鼠胸主動脈NF-κBp65蛋白表達的影響(n=10)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，◇P<0.05

圖3桃紅四物湯對T2DM模型大鼠胸主動脈MCP-1、VCAM-1 mRNA表達的影響(n=10)

3.4 桃紅四物湯對T2DM模型大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和桃紅四物湯低、中、高劑量組大鼠血清TNF-α、TGF-β1含量均顯著下降(P<0.05)；桃紅四物湯降低T2DM大鼠血清TNF-α、TGF-β1的作用具有明顯的劑量依賴性。見圖4。

4 討論

T2DM大血管病變是糖尿病主要并發癥之一，作為一種慢性病理改變，其基礎病理變化主要是內膜粥樣化和纖維化，兼有動脈中層變性和鈣化，早期表現是內皮功能紊亂。糖尿病大血管病變的發生主要與長期慢性的高血糖、脂質代謝紊亂、炎性反應及血管內皮功能受損等因素有關[4]。NF-κB信號通路主要參與機體炎性反應的激活。研究表明，高血糖可刺激NF-κΒ信號途徑活化，繼而激活產生一些細胞因子和生長因子(如TNF-α、TGF-β1)，以及一些黏附分子(如VCAM-1、ICAM-1)，促進細胞增殖，增加血管通透性，引起巨噬細胞的遷移，導致血管內皮功能受損[5]。

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，△P<0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，◇P<0.05；與桃紅四物湯中劑量組比較，□P<0.05

圖4桃紅四物湯對T2DM模型大鼠血清TNF-α和TGF-β1含量的影響(n=10)

中醫學認為糖尿病血管病變與中醫血瘀證有著共同的病理基礎，糖尿病大血管病變為消渴之變證，屬于“痰濁”“血瘀”的范疇。糖尿病早期陰虛熱結，日久傷陰耗氣，而致氣陰兩虛、腎氣不固、經脈失養，由虛致瘀，遂致血脈不通、瘀血阻滯、心脈痹阻[6]。桃紅四物湯來源于清代吳謙等所著《醫宗金鑒》，由四物湯加桃仁、紅花組成，具有養血活血功效。臨床及實驗研究表明，桃紅四物湯對心腦血管系統疾病、糖尿病及其并發癥均有積極的防治作用[7-8]。

本實驗結果顯示，桃紅四物湯干預8周后，T2DM模型大鼠胸主動脈病理損傷顯著改善；且藥物組可顯著抑制模型大鼠胸主動脈NF-κBp65蛋白及VCAM-1、MCP-1 mRNA表達，降低血清TNF-α、TGF-β1的含量。實驗結果表明，桃紅四物湯可有效干預NF-κB信號通路相關蛋白和基因表達，干預T2DM模型大鼠胸主動脈病理損傷，發揮保護糖尿病大血管的作用。

參考文獻：

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(收稿日期：2018-03-29；編輯：姚實林)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of Taohong Siwu Decoction on the thoracic aorta in rats with type 2 diabetes and related mechanism of action.MethodsHigh-sugar and high-fat feed combined with streptozotocin was used to establish a rat model of type 2 diabetes, and these rats were treated with Taohong Siwu Decoction for 8 consecutive weeks. The pathological changes of the thoracic aorta were evaluated. Western blot was used to measure the protein expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in the thoracic aorta; RT-qPCR was used to measure the mRNA expression of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1); ELISA was used to measure the serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1).ResultsAfter 8 weeks of intervention with Taohong Siwu Decoction, the model rats showed a significant improvement in the injury of the thoracic aorta, as well as significant reductions in the protein expression of NF-κBp65 and the mRNA expression of MCP-1 and VCAM-1 in the thoracic aorta and significant reductions in the serum levels of TNF-α and TGF-β1 (allP<0.05).ConclusionTaohong Siwu Decoction can effectively protect the thoracic aorta against pathological injury in rats with type 2 diabetes, possibly by intervention of the NF-κB signaling pathway and inhibition of the expression of MCP-1, VCAM-1, TNF-α, and TGF-β1.

[Keywords] Taohong Siwu Decoction; Type 2 diabetes; Vascular complication; Tumor necrosis factor; Transforming growth factor; Vascular cell adhesion molecule; Monocyte chemoattractant protein