恩度聯合紫杉醇對C57BL/6肺癌小鼠腫瘤生長及CA Ⅸ、HIF-1α表達的影響

趙 娜，羅孟亞男

0 引言

肺癌是惡性腫瘤中發病率和死亡率最高的癌癥之一[1]，全世界每年新增的肺癌病例大約120萬，嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全。目前臨床上常用的治療肺癌的方法有化學治療、放射治療和外科手術治療，化療和放療在殺死癌細胞的同時，也會殺死對機體有益的細胞，不良反應較多，包括放射性食管炎和放射性肺炎[2]；手術治療主要適用于肺癌早期患者，而且肺癌根治術后2年內復發率在80%左右，遠處轉移的發生率高于局部復發率[3]。因此，采用安全有效的藥物治療肺癌成為研究的熱點問題，植物來源的藥物已經普遍應用于癌癥治療中，而紫杉醇是目前最有前景的植物抗癌藥物，與其他抗癌藥物相比具有抗癌范圍廣、藥物效應強的特點。本試驗旨在研究紫杉醇在肺癌治療中的優勢和療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 具有高自發肺轉移潛能的Lewis肺癌瘤株，移植100%，來源:國家實驗細胞資源共享平臺(China Infrastructure of Cell Line Resource)。

1.1.2 實驗動物 C57BL/6近交系小鼠，7～8周齡，體重23～25 g，雌雄各半，購自第一軍醫大學動物中心(合格證號:P7A03)。

1.1.3 主要試劑與儀器 恩度(15 mg/支，國藥準字S20050088，山東先聲麥得津生物制藥有限公司)；紫杉醇(30 mg/支，國藥準字H20053837，安徽大東方藥業有限責任公司)；DAB顯色試劑盒均購自北京中杉公司；免疫組化試劑盒購于福州邁新公司；小鼠缺氧誘導因子1α(HIF-1α)和碳酸酐酶Ⅸ(CA Ⅸ)ELISA試劑盒購自英國Abcam科技有限公司；電子天平購自美國Thermo Fisher Scientific公司；光學顯微鏡和顯微攝像儀購自日本Olympus公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模 將購買的小鼠Lewis肺癌細胞解凍、復蘇，取0.2 ml貼壁生長的對數期(細胞數為1×107/ml)的Lewis肺癌細胞接種于C57BL/6小鼠右腋下，接種后第21天，選取精神和食欲良好的小鼠進行脫頸椎處死，取出生長良好的無破潰的腫瘤組織進行體內傳代：取完整的瘤組織，去除包膜后，選取魚肉狀組織制成單細胞懸液，調整細胞數目為1×107/ml，將癌細胞懸液分別接種于5組小鼠右腋下，0.2 ml/只。

1.2.2 實驗分組 將300只C57BL/6肺癌小鼠按照隨機數字表法平均分成5組，每組60只，雌雄各半，分別命名為空白對照組、正常對照組、紫杉醇低劑量組、紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組，正常對照組注射7.5 mg/m2恩度進行治療，空白對照組注射等量容積生理鹽水，紫杉醇低劑量組、紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組在正常對照組的基礎上分別注射30、100、170 mg/m2紫杉醇進行治療。治療時間為4周。

1.2.3 觀察指標 ①肺癌細胞移植前記錄5組小鼠的體重；②測量治療過程中小鼠腫瘤的生長情況：給藥第4、10、16、22、28天用游標卡尺測量腫瘤的最大徑(a)及最小徑(b)，計算腫瘤的體積(V)，V=ab2/2，繪制腫瘤生長曲線；③記錄5組小鼠的瘤重及抑瘤率：持續治療4周后將小鼠脫頸椎處死，將腫瘤組織剝離出來，記錄腫瘤組織的重量及抑瘤率，抑瘤率(%)=[對照組平均瘤重(g)-實驗組平均瘤重(g)]/對照組平均瘤重(g)×100%。

1.2.4 免疫組化檢測CA Ⅸ、HIF-1α的表達水平及結果判定 持續治療4周后，選取生長良好的腫瘤組織制作石蠟切片(厚度不超過5 mm)，將組織切片在92～98 ℃條件下存放20 min進行抗原修復，滴加正常山羊血清用來中和非特異性反應后，在組織玻片上分別滴加CA Ⅸ和HIF-1α一抗，于4 ℃過夜放置，復溫后在組織玻片上滴加二抗。使用DAB顯色試劑進行底物顯色，當呈現金黃色時終止顯色反應，使用蘇木素進行復染后，用奧林帕斯CCD攝像機隨機采集5個視野(400×)的圖片，觀察CA Ⅸ和HIF-1α蛋白在癌細胞胞核和(或)胞質的表達情況。

1.2.5 ELISA檢測CA Ⅸ、HIF-1α的表達水平 持續治療4周后，各組分別取5只小鼠眼眶靜脈血，采用CA Ⅸ、HIF-1α ELISA試劑盒檢測移植瘤小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α的表達水平。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 五組小鼠體重比較 治療前，五組小鼠的體重相近，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 五組小鼠移植瘤體積的變化情況 從治療后第10天開始，其他各組的腫瘤體積小于空白對照組(P<0.05)，紫杉醇組的腫瘤體積小于正常對照組(P<0.05)，紫杉醇中劑量和紫杉醇高劑量組的腫瘤體積小于紫杉醇低劑量組(P<0.05)，紫杉醇高劑量組的腫瘤體積小于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。結果見圖1、表2。

表1 五組小鼠體重的比較

圖1 五組小鼠移植瘤體積的變化情況

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

2.3 五組小鼠瘤重及抑瘤率的比較 持續治療4周后，其他各組的瘤重低于空白對照組(P<0.05)，紫杉醇組的瘤重低于正常對照組(P<0.05)，紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組的瘤重低于紫杉醇低劑量組(P<0.05)，紫杉醇高劑量組的瘤重低于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。

紫杉醇組的抑瘤率高于正常對照組，且隨著紫杉醇劑量增加，對腫瘤生長的抑制明顯增加。見表3。

2.4 五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達情況比較 持續治療4周后，五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達情況如圖2、圖3所示，與空白對照組和正常對照組比較，紫杉醇低劑量組、紫杉

醇中劑量組和紫杉醇高劑量組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ、HIF-1α表達水平明顯降低。

2.5 ELISA檢測五組小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α表達情況 持續治療4周后，其他各組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達水平顯著低于空白對照組(P<0.05)；紫杉醇治療組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達水平顯著低于正常對照組(P<0.05)；紫杉醇中劑量組和紫杉醇高劑量組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表達水平顯著低于紫杉醇低劑量組(P<0.05)，紫杉醇高劑量組小鼠血清中CA Ⅸ和HIF-1α表達水平顯著高于紫杉醇中劑量組(P<0.05)。見表4。

3 討論

恩度是一種血管內皮抑制素，能通過抑制腫瘤新生血管的生成達到抑制腫瘤的目的，雖然恩度在大多數癌癥的治療中取得了一定效果，但其可導致相關毒副作用，如心血管毒性、肌肉關節疼痛、胃腸反應、肝臟毒性及皮膚過敏反應等。從臨床用藥情況來看，植物抗癌藥物已普遍應用于癌癥治療中，其中應用最廣泛的植物抗癌藥物是天然植物堿[4]。

紫杉醇(Paclitaxel，商品名：Taxol)是從紅豆杉屬植物中提取的一種天然的植物堿，其有效成分是紫杉烷類二萜化合物，是近年來備受關注的抗癌藥物之一。紫杉醇在低濃度下(0.25 μm)即催化微管蛋白的迅速合成，這些微管使細胞分裂停止于有絲分裂期的G2和M期，阻斷了細胞的正常分裂，進而導致細胞凋亡[5-6]。紫杉醇在臨床癌癥治療上取得了顯著效果，申維喜等[7]研究表明，體外環境下紫杉醇可誘導Her-2過表達乳腺癌細胞凋亡，且呈劑量依賴關系。婁源杰等[8-9]采用恩度聯合紫杉醇治療非小細胞肺癌，結果表明，恩度聯合紫杉醇能有效抑制腫瘤的生長、療效較好；周風舉等[10]研究表明，紫杉醇聯合氟尿嘧啶類化療藥對腹膜轉移胃癌有顯著療效；林錦源等[11]研究表明，紫杉醇單藥治療胃癌的有效率約為20%。本研究結果表明，紫杉醇組的腫瘤體積顯著小于空白對照組和正常對照組，且呈劑量依賴型；持續治療4周后，紫杉醇組的瘤重顯著小于空白對照組和正常對照組，紫杉醇組的抑瘤率明顯高于空白對照組和正常對照組，且隨著紫杉醇劑量增加，抑瘤率明顯升高。結果表明，紫杉醇能有效抑制腫瘤細胞生長。

表2 五組小鼠移植瘤體積的變化情況(mm3)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

表3 五組小鼠瘤重、抑瘤率比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

表4 五組小鼠血清中CA Ⅸ、HIF-1α 的表達水平(pg/ml)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與正常對照組比較，#P<0.05；與紫杉醇低劑量組比較，@P<0.05；與紫杉醇中劑量組比較，&P<0.05

圖2 五組小鼠肺癌組織中CA Ⅸ的表達情況(400×)

圖3 五組小鼠肺癌組織中HIF-1α的表達情況(200×)

HIF-1α最先由Semenza等[12]發現，與腫瘤生長、轉移及患者存活有關[13-14]。研究表明，HIF-1α能夠調控一系列基因表達介導組織細胞對缺氧的適應性，從而維持腫瘤細胞的能量代謝、新生血管生成，促進增殖及轉移，同時增強腫瘤細胞對藥物的耐受性[15]。目前，研究者已在多種惡性腫瘤中檢測到HIF-1α蛋白的過度表達，如卵巢癌[15]、腎細胞癌[16]、前列腺癌[17]等。CA Ⅸ位于VLH腫瘤抑制基因的下游，由HIF-1α途徑激活[17]，在正常人體組織中表達較低，但在許多腫瘤如腎細胞癌[16]、前列腺癌[17]和肺癌中表達明顯增強，與腫瘤的發生密切相關[18]。

本研究結果表明，紫杉醇組小鼠組織和血清中CA Ⅸ和HIF-1α的表達水平顯著低于對照組；且隨著紫杉醇劑量增加，CA Ⅸ和HIF-1α的表達水平顯著降低。結果表明，紫杉醇能夠有效降低腫瘤細胞中CA Ⅸ和HIF-1α 的表達水平，推測紫杉醇是通過抑制腫瘤細胞生長來調控CA Ⅸ和HIF-1α 表達。

綜上所述，恩度聯合紫杉醇治療C57BL/6小鼠肺癌能顯著控制腫瘤的生長，降低CA Ⅸ和HIF-1α的表達水平，為肺癌的臨床治療提供一定的參考依據。

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