羅紅霉素抑制COPD大鼠炎性介質釋放對糖皮質激素抵抗的影響

張 松,黃 茂

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以呼吸道氣流受限為主要特征的肺部疾病，其病死率及死亡率均較高，且呈逐年上升趨勢[1-2]。COPD本質上屬于氣道慢性炎癥性疾病，故治療以抗炎為主。糖皮質激素抗炎作用強大，在COPD治療中有著廣泛應用。然而，臨床觀察顯示，部分患者即便采取大劑量糖皮質激素治療，效果也極不明顯，提示患者體內可能存在某種機制，引起機體對糖皮質激素的敏感性降低，即為糖皮質激素抵抗[3-5]。糖皮質激素與糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)結合后方發揮抗炎作用，近年研究發現，GRα型受體是糖皮質激素發揮效應的主要受體，而GRβ型受體則是內源性糖皮質激素效應的拮抗因子，激素抵抗型哮喘患者GRα表達下調、GRβ上調，因此，推測 GRα/GRβ失衡是造成COPD患者糖皮質激素抵抗的重要原因[6-7]。羅紅霉素是新一代的大環內酯類抗生素，臨床公認其在COPD治療中可發揮良好的抗炎作用，然而關于其是否能夠逆轉糖皮質激素抵抗，國內尚未見相關報道[8]。本研究旨在探討羅紅霉素抑制COPD大鼠炎性介質釋放對糖皮質激素抵抗的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性裸大鼠40只，體重18～22 g，月齡4～6個月，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供，動物編號：SCXK(滬)2015-0002；飼養于我院動物中心實驗室SPF環境中，溫度(24±2)℃，濕度30%～60%，常規自由飲食，每天日照12 h，通風良好。實驗時對實驗動物的處理方式符合動物倫理要求。

1.2 藥物與試劑 羅紅霉素(江蘇云陽集團藥業有限公司)，ELISA檢測試劑盒(武漢轉導生物實驗室)，兔抗大鼠GRα多克隆抗體、GRβ多克隆抗體(北京維亞生物技術有限公司)，RT-PCR試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，GRα、GRβ引物(北京博大泰克公司)，通用型SP免疫組化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，DAB顯色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)，蘇木精(美國Sigma-Aldrich公司)，伊紅(上海撫生生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗分組 飼養1周后，選取30只環境適應良好的大鼠，對大鼠進行編號，并采用隨機數字表法分為3組，即空白組、模型組、羅紅霉素組，每組10只。

1.3.2 建立模型 模型組與羅紅霉素組：分別于第1、31、61天由氣管灌注0.2 ml 1.0 g/L的脂多糖溶液，并于2～30 d、32～60 d、62～90 d等3個時間段內將大鼠置于60 L玻璃熏咽箱中被動吸煙，6 h/d。空白組：不予以建模(以0.2 ml生理鹽水與新鮮空氣處理)。

1.3.3 干預 模型組：由第91天起予以生理鹽水灌胃，2 ml/次，1次/d，連續30 d。羅紅霉素組：由第91天起予以羅紅霉素灌胃，劑量為30 mg/kg，1次/d，連續30 d。空白組正常飼養，不予處理。30 d后，行大鼠解剖處理，采集大鼠腹主動脈血2 ml，靜置、離心取血清；分離大鼠右肺前葉，留取肺組織。

1.3.4 炎癥因子檢測 采用ELISA試劑盒檢測血清白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平，嚴格按照ELISA試劑盒進行操作。

1.3.5 肺組織觀察 取適量肺組織，經固定、包埋、切片等處理，并予以HE染色后，采用光學顯微鏡觀察大鼠肺組織病理形態學變化。

1.3.6 肺組織GRα、GRβ mRNA表達水平測定 采用RT-PCR法進行檢測。取肺組織，適當研磨，提取RNA，反轉錄為cDNA。GRα上游引物、下游引物分別為5′-TCCAAAGCCGTTTCACTG-3′、5′-CAAGAGGTCAAAGGTGCT-3′；GRβ上游引物、下游引物分別為5′-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3′、5′-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3′；GAPDH上游引物、下游引物分別為5′-GTTCAACGGCACAGTCAA-3′、5′-CAGATCCACAA

CGGATACA-3′；GRα、GRβ、GAPDH擴增片段為348、266、571 bp。PCR擴增：取反轉錄產物2 ml，上游引物1 μl，下游引物1 μl，10×Easy Tag Buffer(含Mg2+)5 μl，dNTPs 4 μl，Easy Tag DNA Polymerase 0.5 μl，加ddH2O至50 μl。擴增完成后行瓊脂糖凝膠電泳，經EB染色，紫外線投射儀下對電泳條帶進行觀察。GRα、GRβ mRNA表達水平以目的條帶與GAPDH灰度值之比進行描述。

1.3.7 肺組織GRα、GRβ蛋白表達水平測定 取肺組織，加入組織蛋白裂解液，裂解后采集上清液，采用Brad-ford法進行測定。取蛋白樣品，依次行制膠、上樣、電泳分離、脫水等處理。分別加兔抗大鼠GRα多克隆抗體、GRβ多克隆抗體、二抗進行孵育，三種抗體稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶4 000。ECL發光，經凝膠成像儀進行成像，直至膠片透明，掃描后，采用Bandscan5.0軟件分析灰度。

2 結果

2.1 三組肺組織病理形態學特征 空白組：支氣管黏膜上皮細胞完整，無明顯炎性細胞浸潤，肺泡結構連續、緊湊，肺泡壁完整，肺泡腔正常、未見擴大，且無明顯炎性細胞滲出(圖1A)。模型組：支氣管黏膜上皮細胞有明顯脫落，管壁存在大量炎性細胞浸潤，肺泡壁顯著變薄，肺泡明顯擴張，管腔聚集有大量炎性滲出物(圖1B)。羅紅霉素組：支氣管黏膜上皮細胞有少許脫落，管壁有少量炎性細胞浸潤，肺泡輕度擴張，管腔內存在少量炎性滲出物(圖1C)。

2.2 組間血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平比較 與空白組比較，模型組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，羅紅霉素組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3 組間肺組織GRα、GRβ mRNA及蛋白水平比較 與空白組比較，模型組肺組織GRα mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)，GRβ mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，羅紅霉素組GRα mRNA及蛋白表達明顯升高(P<0.05)，GRβ mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 討論

COPD為一種以氣流受限為特征的慢性呼吸系統疾病，發病率及死亡率均較高，嚴重威脅人類健康[9]。被動吸煙是建立COPD模型的常用方法[10]，維持30周以上的被動吸煙便可實現COPD模型成功建立，但為減少實驗等待時間，節省實驗費用，目前常在被動吸煙基礎上聯用其他方法進行建模[11-12]。本研究采用被動吸煙聯合氣管灌注脂多糖的方式進行COPD大鼠模型的建立，結果顯示，以空白組為對照，模型組支氣管黏膜上皮細胞有明顯脫落，管壁存在大量炎性細胞浸潤，肺泡壁顯著變薄，肺泡明顯擴張，管腔聚集有大量炎性滲出物，且模型組大鼠肺組織病理形態學特征與人類COPD的病理形態學改變相符，提示建模成功。呼吸道慢性炎癥是COPD發生的核心機制[13]。IL-8是細胞趨化因子家族的重要成員，在中性粒細胞、T淋巴細胞聚集和活化中發揮著重要作用；TNF-α是重要促炎因子，可刺激巨噬細胞等多種細胞釋放大量炎性因子；MCP-1參與巨噬細胞的聚集和活化，增加炎性細胞浸潤。上述3種炎性介質均被證實參與了COPD的發生發展，與患者預后密切相關[14-16]。本研究中，與空白組比較，模型組血清TNF-α表達明顯增高，肺組織GRα mRNA及蛋白表達降低，肺組織GRβmRNA及蛋白表達明顯降低，驗證了GRα/GRβ失衡是COPD發生的重要機制。

圖1 三組大鼠肺組織HE染色(400×)

組別只數IL-8TNF-αMCP-1空白組10153.54±18.69139.12±18.24113.47±16.72模型組10258.98±27.43*244.69±35.61*244.56±29.41*羅紅霉素組10196.84±21.54#182.36±27.13#152.46±23.26#

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 組間肺組織GRα、GRβ mRNA及蛋白水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

糖皮質激素是治療COPD最有效的抗炎藥物，但對部分患者療效較差。研究認為，吸煙哮喘患者存在顯著的糖皮質激素抵抗，其治療藥物選擇是臨床面臨的棘手問題[17]。大環內酯類抗生素除可發揮抗感染作用外，還具有良好的抗炎作用，因此，該類抗生素在多種炎癥性疾病的治療上有著廣泛應用[18-19]。研究表明，長期應用羅紅霉素可改善COPD患者的臨床癥狀，改善患者生活質量[20]。另有研究顯示，羅紅霉素治療急性加重期COPD，能夠明顯降低患者血清IL-8、TNF-α等炎性介質表達水平[21]。本研究結果顯示，與模型組比較，羅紅霉素組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明顯降低，證實了羅紅霉素的抗炎作用。本研究還顯示，與模型組比較，羅紅霉素組GRα mRNA及蛋白表達明顯升高，GRβ mRNA及蛋白表達明顯降低，表明羅紅霉素對糖皮質激素抵抗有改善作用。

綜上所述，羅紅霉素能夠抑制IL-8、TNF-α、MCP-1等炎性介質釋放，調節GRα/GRβ平衡，對逆轉COPD大鼠糖皮質激素抵抗有積極作用，值得深入研究。

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