即食海產(chǎn)品中納他霉素的測(cè)定方法研究

廖建萌 黃國(guó)方 曾丹丹

納他霉素（ N a t a m y c i n ）的化學(xué)式為C33H47NO13，分子量為665.73 ，熔點(diǎn)：280℃，是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，為白色至乳白色的無(wú)臭無(wú)味的結(jié)晶粉末，微溶于水和甲醇，難溶于非極性有機(jī)溶劑；納他霉素屬于兩性化合物，在酸性或者堿性溶液中溶解度增加，但穩(wěn)定性會(huì)降低。納他霉素阻遏麥角甾醇的生物合成，達(dá)到抑制真菌的作用，對(duì)細(xì)菌和病毒不具有抗菌活性。

納他霉素可用于治療真菌引起的疾病，在食品工業(yè)中作為防腐劑使用，具有無(wú)臭、無(wú)味，低劑量且安全性高的特點(diǎn)，并且不影響奶酪、生火腿的自然成熟過(guò)程。在乳制品中添加納他霉素5～10mg/kg的量可以延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期；肉類食品噴涂4μg/ cm2的納他霉素即可達(dá)到有效的抑菌水平；添加納他霉素可防止水果飲料的變質(zhì)；納他霉素還用于焙烤食品的防腐、水果蔬菜的采后貯藏等。納他霉素?zé)o毒，不致癌、不致敏，但是很難從動(dòng)物或人體的胃腸吸收。

納他霉素的抗菌作用和安全性得到了廣泛認(rèn)可，目前全世界有30多個(gè)國(guó)家允許納他霉素用于食品的生產(chǎn)和保藏，但是對(duì)其在食品中使用的法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)不同。歐盟法規(guī)規(guī)定，納他霉素僅能應(yīng)用于奶酪和香腸的表面防腐處理，禁止在葡萄酒中添加納他霉素； 美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)規(guī)定，納他霉素可用于奶酪表面防腐處理，還可以添加到預(yù)混飼料中；我國(guó)GB2760《食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)納他霉素的使用也作出了具體規(guī)定，值得注意的是，即食類海產(chǎn)制品未在允許添加納他霉素的范圍內(nèi)，意味著納他霉素在即食海產(chǎn)品中不得檢出。

根據(jù)報(bào)道納他霉素的測(cè)定方法主要有生物法、光譜法，色譜法，質(zhì)譜法等方法，生物法操作過(guò)程也比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)；分光光度法靈敏度不夠，測(cè)定即食海產(chǎn)品干擾大；質(zhì)譜法儀器成本高，檢測(cè)即食海產(chǎn)品有基質(zhì)效應(yīng)；色譜法具有準(zhǔn)確、高效、快速的特點(diǎn)。本論文研究高效液相色譜法測(cè)定即食海產(chǎn)品中納他霉素的含量的方法，為即食海產(chǎn)品中納他霉素的檢測(cè)提供技術(shù)參數(shù)。

材料與方法

儀器及材料。高效液相色譜儀：LC20A（日本島津公司）；色譜柱：VP- ODS柱（250 mm×4.6μm，日本島津公司）；電子分析天平（德國(guó)Sartorius 公司）；超聲波提取器（上海比朗）；渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；超純水系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）；離心機(jī)（sigma公司）。

納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%（德國(guó)Dr.Erenstorfer公司）；甲醇（色譜純，美國(guó)CNW公司）；甲酸、氨水（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

儀器條件。流動(dòng)相：甲醇：水（70：30，v/ v），等度洗脫。

流速：1.0mL/min；

色譜柱溫度：35℃；

檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器，波長(zhǎng)305nm；

進(jìn)樣量：20μL。

結(jié)果與討論

溶劑的選擇。分別用2.0%甲酸甲醇溶液、純甲醇溶液和2.0%氨水甲醇溶液將納他霉素配制成濃度分別0.5mg/L、5.0mg/L和50.0mg/L，上機(jī)測(cè)定三次，峰面積取平均值，結(jié)果見(jiàn)表1.

從表1中，看出純甲醇作為溶劑測(cè)定的峰面積結(jié)果最高，納他霉素濃度為0.5mg/L在不同的溶劑中峰面積差別較大，說(shuō)明納他霉素在酸性或堿性溶液中穩(wěn)定性差，濃度越小，穩(wěn)定性越差，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，純甲醇適合作為納他霉素的溶劑。

流動(dòng)相的優(yōu)化。選擇甲醇-水體系作為測(cè)定納他霉素的流動(dòng)相，流速為1.0mL/min，從5.0%甲醇水溶液開(kāi)始，甲醇的比例以5%遞增進(jìn)行測(cè)試，將5.0mg/L濃度的納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣20μL，發(fā)現(xiàn)隨著甲醇比例的增加，納他霉素保留時(shí)間減少，峰展寬變窄，峰面積的變化見(jiàn)圖1。

從圖1中，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇的比例低于50%時(shí)，相同濃度下納他霉素的響應(yīng)值降低，可能的原因是，一方面由于色譜峰有前伸和拖尾的現(xiàn)象較嚴(yán)重，部分納他霉素提前或者滯后流出，未能有效積分；另一方面甲醇比例的減少，納他霉素在溶液體系中部分析出，殘留在儀器管路內(nèi)。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇的比例高于50%時(shí)，相同濃度下納他霉素的響應(yīng)值較高但是變化不大，如果用50%甲醇作為流動(dòng)相，出峰時(shí)間較長(zhǎng)，不利于提高工作效率，而用純甲醇作為流動(dòng)相，出峰時(shí)間過(guò)快使得目標(biāo)峰與其他雜質(zhì)出峰時(shí)間相近，與雜質(zhì)的分離度降低，所以選擇70%甲醇作為流動(dòng)相既保證了分析的效率，又保障了合適的分離效果。

樣品前處理。

（1）提取試劑

選用50%甲醇水溶液，70%甲醇水溶液，純甲醇進(jìn)行提取納他霉素的試劑，在即食海產(chǎn)品樣品中添加納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以回收率作為指標(biāo)，添加濃度為5.0mg/L，結(jié)果見(jiàn)表2。

表中，三種試劑提取的納他霉素回收率在89%以上，50%甲醇水溶液提取的回收率相對(duì)偏低，70%甲醇水溶液和純甲醇都適合作為即食海產(chǎn)品中納他霉素的提取試劑，但是考慮到即食海產(chǎn)品中往往含有大量的脂肪色素等物質(zhì)，純甲醇會(huì)將這些雜質(zhì)更充分的提取，給儀器及色譜柱帶來(lái)更嚴(yán)重的污染，同時(shí)還浪費(fèi)試劑，所以選擇70%甲醇水溶液作為即食海產(chǎn)品中納他霉素的提取試劑，既滿足了分析的要求，并且與流動(dòng)相保持了一致，減少了試劑體系的系統(tǒng)峰。

（2）提取方式

選用70%甲醇水溶液，用不同的提取方式提取即食海產(chǎn)品中的納他霉素。取即食海產(chǎn)品樣品粉碎，稱樣5.0g，加入20mL70%甲醇水溶液，超聲波提取：用超聲波提取器提取30min，冷卻到室溫，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過(guò)0. 22 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)定；浸泡提取：在室溫下放置10小時(shí)，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過(guò)0. 22 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)定；震蕩提取：震蕩60min，5000r/min離心10分鐘，取上層溶液過(guò)0. 22 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)定；結(jié)果見(jiàn)表3。表中表明三種方法提取的結(jié)果差別不大，但是超聲波提取用時(shí)少，更能提高工作效率。

方法學(xué)驗(yàn)證。

（1）線性關(guān)系及檢出限

配制納他霉素的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L和20.0mg/L，上機(jī)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。表明高效液相色譜法測(cè)定納他霉素在1- 20mg/ L的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9995，以基線噪聲的三倍作為測(cè)定的檢出限，納他霉素的檢出限為0.2mg /L。

（2）精密度及回收率

進(jìn)樣5.0mg/L納他霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣11次計(jì)算精密度，結(jié)果見(jiàn)表4，高效液相色譜法測(cè)定納他霉素的精密度為1.49%，精密度符合測(cè)定的要求。

取陰性樣品，稱樣5.0g，分別添加成納他霉素含量為1.0mg/kg、5.0mg/kg和20.0mg/kg的測(cè)試樣品，加入20mL70%甲醇水溶液，超聲波提取30min，離心10分鐘，取上層溶液過(guò)0. 22 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)定，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。高效液相色譜法測(cè)定納他霉素的回收率在90%以上，滿足分析要求。

結(jié)論

建立了高效液相色譜法測(cè)定即食海產(chǎn)品中納他霉素含量的方法，通過(guò)比較溶劑酸化甲醇、氨化甲醇和純甲醇，發(fā)現(xiàn)純甲醇比較適合作為納他霉素的溶劑；優(yōu)化了流動(dòng)相，用70%甲醇水溶液作流動(dòng)相分析納他霉素高效，分離度好；研究了前處理的提取試劑及提取方式，70%甲醇水溶液提取即食海產(chǎn)品中的納他霉素得到較好的結(jié)果，提取的方式選擇超聲波提取法；對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，高效液相色譜法測(cè)定即食海產(chǎn)品中納他霉素的含量的在1.0- 20mg/ L范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9995，檢出限為0.2mg/L，精密度為1.49%，用該方法測(cè)定即食海產(chǎn)品中納他霉素含量的回收率在90%以上。高效液相色譜法測(cè)定即食海產(chǎn)品中納他霉素含量的方法快速，準(zhǔn)確，高效，可滿足檢測(cè)技術(shù)要求。