實時熒光定量PCR定量檢測肉制品中牛/羊/豬源性成分

劉敏 黃小凱 胡秀紅

肉類源性成分鑒定的方法多種多樣，國內外在基因水平上對肉類源性成分進行鑒定的方法也越來越多。但是定性方法只能證明樣品中含有某種源性的肉類而不能證明不含有其他種類的肉類。而且對于肉類摻雜的比例的確定，在標準上還是一片空白。因此，建立一個方法去甄別肉類食品的輕微污染與故意摻假顯得十分重要。本文主要對實時熒光定量PCR定量檢測肉制品中牛/羊/豬源性成分的方法進行研究。

試驗部分

試劑耗材。DNA提取試劑盒。

Taq PCR Master MIX。

DNA標準品。

DNA引物和探針。

儀器設備。實時熒光定量PCR儀。

樣品DNA提取。通過從提取效果、提取時間、提取成本等各個方面考慮，最終選擇了試劑盒法。

標準曲線。動物源性和牛/羊/豬源性：每個run設置標準曲線5個反應、陰性控制1個反應、陽性控制2個反應，每個樣本DNA至少2個反應。

DNA標準品的起始拷貝數為1，000，000，通過用Buffer EB進行稀釋，稀釋至濃度分別為100，000、10，000、1，000、100、10copies/μl。

每個校正點用2μl的標準DNA。將每個反應的拷貝數量都記錄在實時熒光定量PCR儀的分析軟件中，根據檢測到的熒光得到Ct值，從而得出標準曲線。

PCR體系。PCR擴增體系中包含Taq PCR Master MIX 12μL，模板DNA2μL，上下游引物2μL，探針 1μL，加水至25μL。在該體系下，PCR擴增曲線明顯，能達到定量的要求。

PCR程序。本實驗室采用羅氏LC96，以下所列的PCR程序效果比較好。預變性90s，95℃，變性5sec， 95℃，退火10sec， 62℃，延伸15sec， 65℃，循環數為45。熒光通道的選擇FAM，在延伸階段收集熒光。

結果與討論

線性范圍、線性方程、相關系數。通過實驗獲得結果進行數據分析，三種化合物在20～200000拷貝數范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.97。其中各種源性線性如下：

檢出限、精密度和回收率。20和200，000起始拷貝數的標準物質的擴增曲線明顯，陰性對照無明顯擴增曲線，儀器的檢出限可以達到0.01%。結合實際樣品及DNA提取等因素，本方法的檢出限可以達到1%。

按照重量配比，在不含目標源性混合肉中分別摻入1%（w/w）、10%（w/w）和50%（w/w）的目標源性肉類，再取一個純肉樣品，分別進行6個平行的測定，獲得6個平行的實測數值。

通過計算檢出限為1%，精密度小于10%和回收率在85%- 110%之間。

本方法建立了牛/羊/豬源性成分的定量曲線，實現了肉制品中牛/羊/豬源性的相對定量，通過優化實驗步驟和方法，使得檢測時間短、精度較高、穩定性較好。該方法也為制定相關檢測方法標準提供參考。

基金項目：溫州市科技局立項項目（基金編號為S20150025）