氣相色譜法測(cè)定食品中乙酰丙酸的方法驗(yàn)證

朱燕萍

選取市售醬油、飲料、餅干及奶粉樣品，優(yōu)化GB5009.252- 2016的前處理流程，改分液漏斗提取為離心管提取模式，改無水硫酸鈉除水為濾頭過濾，利用GC- FID，從專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限七個(gè)方面對(duì)食品中乙酰丙酸的測(cè)定進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果表明，線性范圍在12.5mg/L- 750mg/L時(shí)，乙酰丙酸的線性相關(guān)系數(shù)r2 在0.9998- 0.9999之間，基質(zhì)加標(biāo)回收率在91.68% - 104.42%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%- 5.64%。方法檢出限為4.9 mg/kg，定量限為16.4 mg/kg，滿足國(guó)標(biāo)GB5009.252-2016的要求。

乙酰丙酸（果糖酸）是酸水解植物蛋白調(diào)味液中存在的一種特殊的有機(jī)酸成分，一般而言，純釀造醬油中，乙酰丙酸的含量極微（<0.01%）。因而，測(cè)定乙酰丙酸的含量，可以判斷是釀造醬油還是氨基酸液配制醬油。然而隨著生活質(zhì)量的日益提高，人們對(duì)于食品安全的關(guān)注度日益提高。GB2760- 2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中也提到了乙酰丙酸，但并未對(duì)添加的量有一個(gè)具體的指標(biāo)。GB5009.252- 2016對(duì)乙酰丙酸的測(cè)定基質(zhì)范圍由之前的醬油擴(kuò)展為食品，其中第一法提出了使用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定食品中的乙酰丙酸。實(shí)際操作中，前處理方法沿襲GB5009.121- 2003（已廢棄）脫氫乙酸的萃取模式，使用分液漏斗振搖萃取，并且比色管靜置的方式對(duì)于易乳化的樣品，需要較多的時(shí)間，無法應(yīng)對(duì)大批量的樣品檢測(cè)。同時(shí)2次水洗的過程對(duì)乙酰丙酸的回收率影響較大。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程，縮短前處理時(shí)間，提高乙酰丙酸的回收率，對(duì)食品中乙酰丙酸的前處理過程加以改進(jìn)。將樣品稱于50ml離心管中，更改分液漏斗萃取為離心管直接提取，更改無水硫酸鈉脫水為濾頭過濾。GB/ T27025- 2008中指出，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)非標(biāo)準(zhǔn)方法、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)（制定）的方法、超出其預(yù)定范圍使用的標(biāo)準(zhǔn)方法、擴(kuò)充和修改過的方法進(jìn)行確認(rèn)，以證實(shí)該方法適用于預(yù)期的用途。故在引用GB5009.252- 2016的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證調(diào)整前處理過程后確保實(shí)現(xiàn)正常進(jìn)行的可行性。

材料與儀器

1.GC- FID氣相色譜：Agilent 7890A

2.乙酰丙酸準(zhǔn)品：Sigma- Aldrich

3.正庚酸標(biāo)準(zhǔn)品：百靈威

4.樣品：市售

5.濃HCL：默克

6.乙醚（分析純）：凌峰

7.乙酸乙酯（色譜純）：DikmaPure

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

1.正庚酸內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5000mg/ L）：稱取0.5g正庚酸（精確至0.00001），用乙酸乙酯定容至100ml容量瓶，混勻。

2.乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（5000mg/L）：稱取0.5g乙酰丙酸（精確至0.00001），用乙酸乙酯定容至100ml容量瓶，混勻。

儀器參數(shù)

1.參數(shù)

色譜柱：D B - W A X毛細(xì)管柱 （ 3 0 m×0.25mm×0.25μm）

柱溫：120℃，保持1min，以8℃/min程序升溫至230℃，保持4min

進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度：270℃

載氣：高純氮，純度99.999%，流速：1.0mL/min

氫氣流速：30mL/min

空氣流速：300mL/min

尾吹氣流速：30mL/min

進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：25：1

進(jìn)樣體積：1ml

2.乙酰丙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

分項(xiàng)綜述

1.專屬性

專屬性是指明確地測(cè)定出目標(biāo)化合物的能力，考慮不純，降解和基質(zhì)影響等因素。測(cè)試項(xiàng)目及觀察值，見表1。

3.準(zhǔn)確度及精密度

選取4種不同基質(zhì)樣品中，分別進(jìn)行低，中，高濃度水平的加標(biāo)，每個(gè)濃度試驗(yàn)三次，評(píng)估回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（1）前處理過程：

稱取5.00g事先均勻化的樣品于50mL離心管，加入1.0mL正庚酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)，樣品中加標(biāo)濃度水平分別是25mg/ kg，500mg/kg，1500mg/kg。加入10mL飽和NaCl溶液， 3.0mL濃鹽酸。充分渦旋1min后，加入25ml乙醚，渦旋3- 5min，離心分離5min。吸取上層有機(jī)相于150mL平底燒瓶，再重復(fù)萃取兩次，合并乙醚萃取液。45℃左右旋蒸至干，用乙酸乙酯定容至10ml，過濾上機(jī)。

（2）所得數(shù)據(jù)如下，計(jì)算樣品中乙酰丙酸回收率。

（3）小結(jié)

從試驗(yàn)數(shù)據(jù)得知，回收率最低的是91.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最低的是5.64%。實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，醬油及奶粉易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，離心分離的過程減少了等待的時(shí)間，并且減少水洗和無水硫酸鈉吸附過程后回收率保持較好的水平。同樣的，不同基質(zhì)的橫向比較，能查看到餅干及奶粉這種含油樣品，在旋蒸后含油量較高，峰型出現(xiàn)稍許拖尾，參考文獻(xiàn)固相萃取-氣相色譜聯(lián)用測(cè)定醬油中乙酰丙酸，可以考慮之后對(duì)含油量較高樣品進(jìn)行除油的操作來降低油脂的影響。

4.檢測(cè)限和定量限

方法檢測(cè)限（MDL），MDL=3SD；定量限（LOQ），LOQ=10SD。

在不同基質(zhì)樣品中，進(jìn)行10次曲線最低點(diǎn)加標(biāo)再現(xiàn)性試驗(yàn)，評(píng)估3SD和10SD。

（1）加標(biāo)溶液配制：

稱取10份混合均勻的不同基質(zhì)樣品5克，并對(duì)其加標(biāo)，加標(biāo)濃度為25mg/kg，其余步驟同上。得到樣品加標(biāo)理論濃度為25mg/kg。

（2）小結(jié)：

乙酰丙酸方法檢出限為：4.93mg/kg

乙酰丙酸定量限為：16.4 mg/kg

滿足GB5009.252- 2016第一法的要求：檢出限10mg/kg， 定量限25mg/kg。

用離心管代替分液漏斗萃取，改善靜置為離心的方式完成GB5009.252-2016方法的測(cè)試，滿足測(cè)試所需各項(xiàng)要求。在針對(duì)多批量樣品時(shí)，前處理?xiàng)l件的改善，不僅減少了時(shí)間和人力成本，也提高了實(shí)驗(yàn)的回收率及效率，可以證明本實(shí)驗(yàn)室具備食品中乙酰丙酸測(cè)試的能力。