基因診斷中測序技術的應用及優缺點

陳躍龍

基因測序技術已廣泛應用于分子生物學和基礎醫學領域。本文主要介紹了第一、二、三代測序技術的優缺點，第三代測序技術在生物醫學領域的應用，以及第四代測序技術的研究進展。基因組攜帶個體的所有遺傳信息，基因測序可以加深對疾病特別是惡性腫瘤分子機制的認識，在診斷和治療中發揮重要作用。

測序技術在基因診斷中的應用

運用第一代的測序技術，不管是Sanger雙脫氧鏈終止法，還是Maxam和Gilbert化學裂解法，都需要放射性同位素標記，操作復雜，自動化程度低，不能滿足基因大規模測序的要求。而在實踐中，毛細管陣列DNA測序時間長、成本高，不能滿足基因組學發展的需要。

單分子DNA測序。第三代測序技術是在單細胞和單分子水平上進行基因組測序的新技術。2007年以來，DNA平臺已被廣泛使用。同時，人類單體型項目、人類基因組計劃1000和癌癥基因組計劃等重大國際合作項目也日益成為基因組研究的頂峰。所有的材料都進行了測序，并且是與DNA混合的大量細胞樣品。這些材料不能滿足微生物生態學、腫瘤基因組學、法醫學，微觀診斷和遺傳印記研究領域的要求。第三代測序技術以實時測序和納米多孔單層技術為標志，為解決這些問題打開了新的門戶。

不像NGS依靠DNA模板對PCR擴增來結合固體表面，然后合成并測序，第三代測序是單分子測序，不需要進行PCR的擴增。第三代基因測序技術中有三種主要類型：單一測序、單鏈Helico測序技術和單個納米粒子測序技術等。

SMRT測序原理。使用熒光標記的DNA在顯微鏡下實時記錄熒光強度的變化。熒光標記的DNA結合DNA鏈，同時檢測DNA鏈中的熒光，當它與DNA鏈形成化學鍵時，熒光團DNA聚合酶被去除。熒光DNA不影響DNA聚合酶的活性，DNA鏈的熒光自然與DNA鏈相同。

牛津納米棒單分子測序原理：生物納米孔由α-溶血素構成，外溶酶附著在底部孔的外表面。環糊精的共價合成連接到嵌入脂質雙層中的孔的內表面。預處理不同的鹽濃度應該基于兩個脂質雙層。在適當的電壓下，單鏈DNA被切割并且單鏈DNA進入孔中，與孔中的環糊精瞬時反應。這會影響通過毛孔的原始電流。

腺嘌呤與胸腺嘧啶（T）和胸腺嘧啶（T）相似，但與其他核苷酸相比，T在環糊精中的滯留時間為3倍。胞嘧啶（G）和停留時間也不同。因此，每個基因和當前的干擾幅度是唯一的。此外，由于C-甲基化在環糊精中的停留時間大約為正常C停留時間的2倍之久，所以C-納米孔單分子序列的甲基化可以以99.9%的準確度直接讀出，而無需重復測序孔快速去除。

測序技術的發展及其優缺點

DNA測序是基因診斷史上具有里程碑意義和劃時代意義的技術革命，被稱為基因診斷的黃金標準。桑格在1977年發明了基因測序技術以來，基因測序技術誕生已經有40多年，它廣泛應用于遺傳病的基因診斷和產前/植入前診斷，特別是單基因疾病。2007年，羅氏公司伊利米納公司和ABI公司發明了高通量測序技術，即下一代測序技術。然而，測序技術的發展至今仍未停止，以單分子實時測序和納米孔技術為標志的第三代測序新產品也進入了歷史階段。

優點。（1）DNA聚合酶的反應迅速，能較好地實現基本的測序技術，可在1秒內測量10個核苷酸。測序速度為化學測序的速度的二萬倍。（2）DNA聚合酶反應具有持續性，可以進行長時間的基因測序，這種技術可以用來測量數千個堿基。高精度，高達99.999999%。這將大大減少體外轉錄。（3）基因聚合酶能夠測出不同基因序列，基于時間差異，可以確定模板C是否被甲基化。可以獲得許多重要的突變，節省項目成本。（4）挖掘DNA突變和來源的頻率，驗證率很高。（5）基因測序技術能夠有效的預防癌癥的發生。（6）區分正常和癌癥遺傳變異水平。（7）基因組測序，因為它讀取時間長，可以精確預測癌細胞的減少數量。在基因組測序中，重疊群測序重疊群（重疊后）顯著減少了隨后的基因組裝配和注釋的工作量，節省了大量時間。它比NGS快得多。因此，基因組測序和表征被廣泛用于細菌和病原體。單分子測序的優點在突變或SNP鑒定的病理學檢測中是無與倫比的。沒有PCR擴增步驟，擴增過程中的基本錯誤沒有出現這種優勢。允許它以特定的順序檢測SNP。產前診斷中的突變和罕見頻率測定在植入前基因診斷中具有獨特優勢。（8）除了具有一定程度的組織和分化的人類和小鼠細胞的基因組測序外，它們也適用于各種細胞類型。對單細胞如腫瘤細胞、干細胞、循環腫瘤細胞、單個生殖細胞，胚胎細胞以及細胞（神經，表皮等）進行第三代測序。測序技術具有高通量測序，長讀數時間短，成本低，測序時間短，初始劑量少，檢測精度高，即使變化小。

缺點。為了使基本測序技術更好地適用于基因的自動化識別、優質的基因測序，因此不適合單基因的檢測，例如需要單基因疾病，則檢測結果不太準確。另外，盡管第三代測序技術還不夠先進，但仍然需要的酶（或核酸聚合酶）以及如何保持其活性和穩定性仍然是一個重要問題。對于太平洋生物科學技術的優化升級，可以通過提高單基因的測序結果，來進一步完善生物科學技術的檢測升級。但是，仍然需要降低背景噪音和DNA速度控制。另外，如何在DNA固定的前提下解決和提高DNA分子結構的延展性。

總結與建議

近年來，基因測序技術發展迅速。雖然第一代測序技術在各種檢測平臺上仍然十分活躍，但第二代和第三代測序器相繼出現，第四代測序技術日趨完善。第一代至第四代測序技術有其優缺點。（1）第一代Sanger測序技術具有成本高、吞吐量低、讀取長度長、精度高等優點。對于較小的樣本，排序仍然是最好的選擇。（2）第二代測序技術發展迅速，產量高、成本低，已被廣泛應用于大規模測序。但第二代測序技術的主要缺點是閱讀長度相對較短。（3）第三代測序技術不僅增加了閱讀長度，而且直接檢測RNA序列和甲基化序列。第三代測序技術仍在發展中。其中，離子流測序庫的制備過程繁瑣，讀取長度不足，SMRT測序技術的有效響應孔數不足，原始測序數據的準確性不高。（4）第四代測序技術是以第三代測序技術為基礎的。與前三代相比，具有代表性的納米孔測序技術在成本和速度上都有了很大的提高，儀器也越來越小型化。基因測序技術是人類探索生命奧秘的重要手段之一。它在生命科學和生物醫學的發展中發揮了巨大的作用。盡管最先進的納米級技術已經取得了許多進展，但它仍然面臨著許多挑戰。例如，DNA控制和納米孔制造仍處于實驗室階段.。我們有理由相信，新一代測序技術的困難將逐步克服，在基因測序的指導下對遺傳病的診斷和治療。精確化的基因治療能取得更好的臨床療效，基因測序技術將對未來人類健康產生重大影響。