NOB 1對宮頸癌細胞糖酵解及凋亡影響的實驗研究

楊棟霞，馬桂霞

鄭州市第一人民醫院婦科，鄭州450004

宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤，其發病率僅次于乳腺癌[1]。據統計，全球范圍內有超過85%的宮頸癌患者發生于發展中國家，治療失敗、復發率高等是宮頸癌致死的重要原因[2]。腫瘤細胞有著與正常細胞不同的能量代謝方式，盡管在氧氣充足的環境下仍然以糖酵解為主要代謝途徑，這種代謝方式能夠增加腫瘤細胞的耐受能力，從而促進腫瘤的發展[3]。NOB1是一種鋅帶蛋白，能夠調控溶酶體的形成和成熟，在核糖體小亞基的合成中發揮促進作用[4]。NOB1與細胞內基因的轉錄和翻譯有關，在正常癌旁組織中表達水平明顯低于腫瘤組織[5]。有研究表明，NOB1下調后的骨肉瘤細胞、腎透明細胞癌細胞等腫瘤細胞的增殖活力下降，細胞周期紊亂[6-7]。癌細胞的生長需要糖酵解途徑提供能量，對于NOB1在宮頸癌細胞糖酵解及細胞凋亡中的作用尚不明確。本研究主要探討NOB1在宮頸癌細胞糖酵解和凋亡中的作用，為靶向治療宮頸癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞HeLa購自中國科學院細胞庫；NOB1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物由上海生工合成；胰蛋白酶、己糖激酶Ⅱ（hexokinaseⅡ，HK-Ⅱ）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒均購自美國Sigma公司；Lipofectamine 2000購自美國Thermo公司；兔抗NOB1一抗、兔抗β-連環蛋白（β-catenin）一抗和兔抗c-myc一抗購自美國Abcam公司；NOB1siRNA、siRNA control均購自美國Roche公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒、cDNA合成試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 細胞培養及轉染

宮頸癌細胞用含有胎牛血清總體積10%和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養液培養。將保存在液氮中的細胞取出后，放置于溫度設定為37℃的水浴中，搖動溶解。將細胞轉移到6 cm的培養皿后，加入3 ml的細胞培養液，在37℃、5%CO2培養箱中培養。密度達到90%后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min。1500 rpm離心3 min。棄上清，加入1 ml的培養液懸浮細胞，接種到細胞培養皿中繼續培養。用Lipofectamine 2000將NOB1siRNA、siRNA control轉染至宮頸癌細胞中，記為NOB1siRNA組、siRNA control組，同時以未轉染的細胞為對照組。

1.3 RT-PCR檢測轉染效果

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養48 h后，每個6孔板每孔加入1 ml的Trizol裂解細胞，提取細胞總RNA。逆轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR，步驟參照瑞士羅氏的FastStart Universal SYBR Green MasterMix說明書。NOB1-正義：5'-GAAAGAACAACGCCCTGGAG-3'，NOB1-反義：5'-CAGCCTTGAGATGACCTAAGC-3'；GAPDH-正義：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，GAPDH-反義：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。反應條件：95 ℃，10 s；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；共40個循環。運用△△Ct法分析相對表達量：以GAPDH為內參基因，取內參和目的基因的Ct值的差值，△Ct=Ct目的－Ct內參，△△Ct=（轉染組目的基因Ct值－轉染組內參基因Ct值）－（對照組目的基因Ct值－對照組內參基因Ct值）。實驗重復3次，取均值。

1.4 細胞凋亡檢測

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養48 h后，加入胰蛋白酶消化細胞，收集106個細胞，用冰預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入200 μl的結合緩沖液混合后，依次加入5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）和 5 μl膜聯蛋白 V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）孵育反應10 min。在細胞懸浮液中加入400 μl結合緩沖液，在1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次，取均值。

1.5 HK-Ⅱ和LDH活性檢測

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養48 h后，收集各組細胞，用HK-Ⅱ和LDH活性檢測試劑盒檢測細胞中HK-Ⅱ和LDH水平。實驗重復3次，取均值。

1.6 Western blot法檢測NOB 1、 β-catenin和c-myc蛋白表達

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞培養48 h以后，按照蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用12%分離膠、4%濃縮膠進行電泳，80 V電壓跑膠30 min，將電壓加至120 V，直到蛋白標準品進入分離膠底部邊緣。300 mA轉膜90 min。用5%的胎牛血清白蛋白室溫搖床封閉1 h。TBST洗3次，每次5 min。加入1000倍稀釋的一抗，4℃過夜反應。TBST洗3次，每次5 min。與3000倍稀釋的二抗室溫反應2 h。ECL發光，曝光，用目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對表達水平。實驗重復3次，取均值。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟-件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NOB 1蛋白表達的檢測結果

siRNA control組細胞中NOB1mRNA和蛋白表達水平與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞中NOB1mRNA和蛋白表達水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

圖1 Western blot法檢測NOB 1蛋白表達情況

表1 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞中NOB 1表達水平的比較（ n= 3，±s）

表1 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞中NOB 1表達水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值1.00±0.08 0.98±0.12 0.32±0.04*60.161 0.000 0.93±0.09 0.94±0.07 0.25±0.06*84.813 0.000 NOB1 mRNA NOB1蛋白

2.2 細胞凋亡檢測結果

siRNA control組、NOB1siRNA組、對照組細胞凋亡率分別為（12.04±1.14）%、（45.21±4.22）%、（11.25±1.36）%，3組比較，差異有統計學意義（F=161.337，P=0.000）；其中，siRNA control組細胞凋亡率與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞凋亡率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

2.3 HK-Ⅱ和LDH活性檢測結果

siRNA control組細胞HK-Ⅱ和LDH水平與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞HK-Ⅱ和LDH水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞HK-Ⅱ、LDH活性的比較（ n= 3，±s）

表2 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞HK-Ⅱ、LDH活性的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值HK-Ⅱ（×103U/g）165.37±14.23 158.54±16.35 89.66±10.70*27.014 0.001 LDH（×103U/g）3124.58±286.84 3018.86±256.73 1896.12±142.57*24.753 0.001

2.4 β-catenin和c-myc蛋白表達檢測結果

siRNA control組細胞β-catenin和c-myc水平與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；NOB1siRNA組細胞β-catenin和c-myc水平均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖3、表3）

圖3 Western blot法檢測β -catenin和c-myc蛋白表達情況

表3 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞β-catenin和c-myc蛋白表達水平的比較（ n= 3，±s）

表3 siRNAcontr ol組、NOB 1 siRNA組、對照組細胞β-catenin和c-myc蛋白表達水平的比較（ n= 3，±s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組NOB1 siRNA組F值P值β-catenin 1.15±0.11 1.18±0.13 0.32±0.04*70.069 0.000 c-myc 0.68±0.07 0.69±0.05 0.26±0.04*60.233 0.000

3 討論

NOB1蛋白最初在酵母雙雜交中被發現，參與核糖體RNA合成[8]。人NOB1基因含有8個內含子和9個外顯子，位于16q22.1染色體上，其編碼的蛋白含有一個PIN結構和一個ZNRD1結構，在蛋白酶體合成中發揮關鍵作用[9]。NOB1蛋白在卵巢癌組織中的mRNA表達水平高于正常的癌旁組織和良性腫瘤組織，而干擾NOB1表達后的卵巢癌細胞增殖能力和細胞克隆形成能力明顯受到抑制[10]。張向民[11]通過免疫組化的方法檢測NOB1在前列腺癌組織中的表達水平，結果發現，NOB1在前列腺癌組織中過表達。

細胞能量代謝能夠將有機物轉化為能量，屬于新陳代謝中的一種。正常情況下，葡萄糖可以通過有氧氧化、糖酵解兩種途徑產生能量，當細胞中氧氣充足時以有氧氧化為主，只有在氧氣不足的情況下才會通過糖酵解供能[12]。癌細胞有著與正常細胞不一樣的代謝方式，其無論是在氧氣充足還是氧氣不足的情況下均以糖酵解為主要方式，這種方式稱為“Warburg效應”[13]。HK作為糖酵解過程中的第一個限速酶，在腫瘤組織中過度表達，參與腫瘤的發生發展[14]。HK-Ⅱ是HK的一種亞型，是與腫瘤關系最為密切的HK[15]。LDH能夠將丙酮酸催化形成乳酸，是腫瘤細胞糖酵解中的關鍵調控酶[16]。已經有研究表明，HK-Ⅱ、LDH在結直腸癌等腫瘤中活性異常升高，能夠促進細胞增殖[17-18]。

王宇華等[19]發現，NOB1在宮頸癌患者中的陽性表達率為71%，而在宮頸炎患者中的表達水平只有7%。楊桂春等[20]發現NOB1在宮頸癌中的表達水平與患者的生存率、臨床資料等具有相關性，是一種潛在的用于宮頸癌治療和預后的癌基因。本研究結果顯示，NOB1下調后的宮頸癌細胞凋亡率升高，細胞中HK-Ⅱ、LDH活性降低，細胞糖酵解水平降低。本研究結果同樣說明了NOB1是一種癌基因，并且進一步表明了NOB1對宮頸癌細胞糖酵解的調控作用。對于NOB1在其他宮頸癌細胞中的作用是否同本研究一樣需要進一步探討。

Wnt/β-catenin是Wnt的經典信號通路，不僅可以調控正常細胞的增殖，還與腫瘤細胞的多種生物學特性有關[21]。β-catenin 作為 Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白，在腫瘤中過度表達，c-myc是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因，Wnt/βcatenin信號通路激活后促進c-myc的表達[22]。本研究結果顯示，NOB1表達下調后的宮頸癌細胞中β-catenin和c-myc蛋白表達下降，Wnt/β-catenin信號通路激活受到抑制，而對于其具體的調控機制仍然需要驗證。

綜上所述，NOB1下調后宮頸癌細胞凋亡增多，細胞糖酵解途徑調控酶HK-Ⅱ、LDH活性降低，細胞糖酵解水平下降。NOB1是一種癌基因，其作用機制可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。本研究結果為探討NOB1在宮頸癌中的作用機制奠定了基礎，為靶向NOB1治療宮頸癌提供了理論基礎。

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