外周血循環腫瘤細胞在不同階段和不同類型肺癌中的價值研究

肖鵬，梅家轉，李瑞君，白樺，栗敏，劉桂舉鄭州人民醫院腫瘤內科，鄭州450003

肺癌是對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居惡性腫瘤中前列，且近年來均呈逐年上升趨勢，一直是全球關注的重點問題。發病隱匿、易復發轉移是肺癌重要的死亡原因之一[1-2]。循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是近年提出的一種新概念，是存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱。大部分CTC可被自身免疫系統識別并清除，但小部分CTC能夠逃逸并隨血液循環轉移至其他部位，形成轉移灶，這也是腫瘤轉移的至關重要的組成部分，在腫瘤分期、監測及預后判斷等方面具有重要的臨床應用價值。不同類型、不同階段的腫瘤，CTC的分布及侵襲能力也不盡相同[3-4]。根據世界衛生組織病理學分類原則，肺癌可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種類型，非小細胞肺癌又可以細分為腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌3種類型[5]。根據國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）第七版肺癌TNM分期標準，肺癌T分期包括T0、Tis、T1（a/b/c）、T2（a/b）、T3和 T4；N 分期包括 N0、N1、N2和N3；M 分期包括 M0和 M1（a/b/c）[6]。本研究擬通過免疫磁珠陰性富集法聯合免疫細胞熒光染色法檢測不同階段、不同類型肺癌患者外周血中CTC的情況，并分析其與患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年2月至2014年2月于鄭州人民醫院接受治療的148例肺癌患者為肺癌組。納入標準：①臨床癥狀、實驗室檢查及病理診斷等均符合2011版原發性肺癌診療規范中關于肺癌的診斷標準[7]；②入組前均未接受任何抗腫瘤相關治療；③均首次被診斷為肺癌。排除標準：①無病理診斷結果；②合并其他原發性腫瘤或轉移性腫瘤者；③依從性差或有精神疾病者。選取同期于本院接受治療的79例肺部良性疾病患者為肺部良性疾病組。納入標準：①符合肺部良性疾病的診斷；②臨床所有檢查均排除腫瘤性疾病。另外，選取同期于本院接受體檢的15例健康成人的檢測結果作為對照。納入標準：①全身體檢基本正常；②無肺癌相關高危因素。肺癌組患者中，男93例，女55例；年齡21～72歲，平均（45.19±11.03）歲。肺部良性疾病組患者中，男50例，女29例；年齡18～70歲，平均（44.28±10.76）歲。健康對照組中，男10例，女5例；年齡20～71歲，平均（43.54±12.52）歲。3組對象的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器

人抗CD45磁珠抗體試劑盒、鼠抗人CD53單克隆抗體、人藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）均購自加拿大Stemcell公司；鼠抗人Pan-CK、甲狀腺轉錄因子-1（thyoid transciiption factor-1，TTF-1）和DAPI單克隆抗體均購自美國Cell Signaling公司；FACS AriaⅢ流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 入組前，采集所有入組對象的外周血7.5 ml，具體操作步驟：選擇肘正中靜脈，嚴格消毒，采用真空采血管（含EDTA）采集7.5 ml外周血，棄去前端1.5 ml血液，以避免血管內皮細胞和上皮細胞污染血液。在采集后24 h內完成外周血CTC的富集，以保證結果的準確性。

1.3.2 免疫磁珠陰性富集法捕獲CTC 去除紅細胞：向7.5 ml外周血中加入紅細胞裂解液，振蕩混勻，離心后棄上清，后用10%胎牛血清和含1 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸細胞。去除白細胞：富集CTC，遵循試劑盒說明書要求，向重懸細胞液中添加人抗CD45磁珠抗體去除白細胞，隨后再次進行細胞重懸。再次去除白細胞，同時富集CTC：向細胞重懸液中添加PE標記的鼠抗人CD53單克隆抗體進行免疫熒光染色，后使用PE陽性試劑盒進行篩選，完成CTC的富集。具體操作步驟嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.3.3 流式細胞儀檢測經免疫熒光染色后的CTC參照參考文獻[8]進行以下操作：將富集后的CTC上機（流式細胞儀），并同時向其中添加FITC標記好的鼠抗人Pan-CK、TTF-1和DAPI單克隆抗體，FACS AriaⅢ流式細胞儀鑒定CTC并進行計數，隨后采用FlowJo 7.2.5軟件對流式細胞儀的檢測結果進行分析。

1.4 隨訪方法

采用電話、上門隨訪或門診復診等方式對肺癌組患者進行隨訪，以了解CTC檢出與未檢出肺癌患者的生存情況，隨訪日期截至患者死亡或2017年2月。

1.5 判定標準

CTC是CD45抗體陰性，而Pan-CK、TTF-1和DAPI均陽性的細胞。由于健康對照組和肺部良性疾病組的外周血中也可能存在CTC，故設定此類CTC的閾值均為1，只有所有外周血CTC數值＞閾值時才納入統計學分析。

1.6 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析。計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTC檢出率的比較

健康對照組、肺部良性疾病組和肺癌組的CTC檢出率分別為6.67%（1/15）、17.72%（14/79）、93.92%（139/148），3組CTC檢出率比較，差異有統計學意義（χ2=154.2，P＜0.01）；其中，肺部良性疾病組與健康對照組的CTC檢出率比較，差異無統計學意義（χ2=0.47，P＞0.05）；肺癌組的CTC檢出率明顯高于肺部良性疾病組和健康對照組，差異均有統計學意義（χ2=135.2、85.6，P＜0.01）。

2.2 CTC檢出率與肺癌患者臨床特征的關系

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、M分期為M1期的肺癌患者的CTC檢出率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、M分期為M0期的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），而不同性別、年齡、組織學類型、T分期和N分期的肺癌患者的CTC檢出率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

2.3 CTC檢出與未檢出肺癌患者生存率的比較

截至隨訪結束，CTC檢出肺癌患者的生存率為23.78%，低于CTC未檢出肺癌患者的63.85%，差異有統計學意義（χ2=4.86，P=0.03）。

3 討論

易發生遠處轉移是肺癌作為惡性腫瘤的重要原因之一，嚴重影響了肺癌患者的治療效果和預后。有研究顯示，不同類型、不同臨床分期的肺癌，其遠處轉移情況也不同，這提示遠處轉移能力與肺癌的類型及臨床分期有關[9]。相關研究表明，CTC是腫瘤發生轉移的前提和關鍵環節，但CTC具有較大的異質性，腫瘤類型不同或腫瘤所處的階段不同，其能力和狀態也不盡相同，僅有小部分CTC可在循環的外周血中完成轉移并定植形成轉移灶，因此，實時監測外周血中CTC的情況對臨床腫瘤的治療及預后判斷具有重要意義[10]。

表1 CTC檢出率與肺癌患者臨床特征的關系

近年來，隨著科學技術的飛速發展，CTC的檢測技術也在不斷進步更新，目前CTC的檢測技術主要包括免疫磁性捕獲分離技術、免疫組織化學技術、以PCR為基礎的檢測技術、FISH技術、細胞形態學分析和基于微流控芯片的CTC捕獲技術等，其中免疫組織化學技術仍是評價CTC檢測方法的“金標準”[11]。本研究通過免疫磁珠陰性富集法聯合免疫細胞熒光染色法（流式細胞儀檢測）對CTC進行檢測，結果顯示肺癌組、肺部良性疾病組和健康對照組的CTC檢出率分別為93.92%、17.72%和6.67%，差異有統計學意義（P＜0.01），表明該方法在CTC的檢測上具有較高的敏感度和特異度，這與尹寒露等[12]研究結果基本一致。本研究還發現，臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、M分期為M1期肺癌患者的CTC檢出率分別高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、M分期為M0期的患者（P＜0.05），這提示CTC檢出率與肺癌患者的臨床分期有關。這與李晶等[13]研究結果基本一致，但也有研究認為CTC檢出率與肺癌的臨床分期無關[14]，推測其原因可能與研究對象的納入情況和樣本量有關。

綜上所述，大部分肺癌中均存在CTC，其檢出率與肺癌的臨床分期及遠處轉移相關，早期檢測CTC有利于肺癌患者病情的評估。

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