高濃度檸檬酸對釀酒酵母生長的抑制效應

王寶石，李林波，武忠偉，張 蕾，陳 鋒，陳 林，張明霞*

（1.河南科技學院 生命科技學院，河南 新鄉 453003；2.現代生物育種河南省協同創新中心，河南 新鄉 453003）

山葡萄、越橘、山楂等是含有較高酸度的釀酒原料，其酸度一般為12.0～20.0 g/L，大多需要進行降酸處理才能進行發酵[1]。果酒降酸的方法主要有化學降酸法、物理降酸法和生物降酸法[2]，化學降酸和物理降酸會造成酒體不穩定、苦澀味、風味物質及有益成分的損失和顏色的吸附等，生物降酸目前僅對果酒中的蘋果酸有效。而富含檸檬酸類果實的pH值可低至1.9，高檸檬酸含量、低pH值（pH＜3.0）環境因素對釀酒酵母生長的影響少有報道。因此，如何提高釀酒酵母耐受高檸檬酸、低pH值的環境脅迫并改善其發酵性能，是果酒開發和品質提高所面臨的主要問題。

高有機酸、低pH是果酒釀造中酵母面臨的主要環境脅迫。釀酒酵母是果酒發酵的主要微生物，但果酒發酵醪液不是釀酒酵母的最佳生理環境。發酵過程中，釀酒酵母持續受到有機酸、pH、滲透壓、SO2和乙醇等多種環境因子的脅迫[3-5]，尤其是來源于果酒釀造原料的有機酸引起的低pH脅迫[6-7]。有機酸脅迫不是簡單的高氫離子的毒性，而是依賴于生物體所暴露的酸化學性質[8]。有機酸會導致釀酒酵母體內pH的改變，影響細胞壁的結構，改變質膜中蛋白質的構型，引起原生質膜對某些離子滲透性的變化，從而影響酵母的正常生理功能、酒精發酵的速度、發酵產物的組成[4，9]。在弱有機酸條件下，為了抵抗細胞內環境的酸化，酵母細胞會增加質膜H+-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶的活性，將質子排出，以保持細胞內部pH的穩定[10-11]。但若僅排出質子，則酸根離子將導致酵母細胞內部滲透壓的增加。目前越來越多的研究表明酸根離子的排出也跟質膜相關，主要由質膜ATP結合區轉運子（Pdr12p）來完成[12]。關于酵母細胞的抗酸性，除質子泵外，其他泵也可能參與了酵母細胞陰離子排出[13]。有酸脅迫也將導致氧化脅迫，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性增強[14]。目前，有機酸脅迫對釀酒酵母的影響及其應激反應的研究主要集中在生物乙醇生產中的乙酸脅迫[15-17]、乳酸脅迫[14]，以及在食品防腐劑如山梨酸鉀、苯甲酸鈉的脅迫等方面[18]。主要從基因水平（如ATP結合區轉運子Pdr12）、轉錄水平（轉錄因子war1p、Fps1p）、蛋白質水平（質膜H+-ATP酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶）研究酵母細胞對有機酸脅迫的應答機制[19-20]。但有機酸的種類繁多，各自理化特性差異大，很多有機酸并不遵循典型的酸脅迫理論[21]。NIELSEN M K等[22]研究了在pH3.0、4.0、4.5條件下檸檬酸對釀酒酵母生長代謝的影響，結果發現pH越高，對釀酒酵母的生長抑制越明顯，這顯示檸檬酸與典型弱有機酸防腐劑的抗微生物機制不同。檸檬酸可能通過鰲合基質中的Ca2+和Mg2+來抑制釀酒酵母生長[22-23]，另外釀酒酵母能通過高滲甘油分裂素激活蛋白激酶途徑適應檸檬酸對其造成的脅迫[23]。因此，分析檸檬酸及相應pH值對釀酒酵母生長及酒精發酵的影響，是高檸檬酸、低pH原料的發酵研究基礎，是果酒質量控制和品質提高的依據。本研究從5種釀酒酵母中篩選了兩種代表性的菌種釀酒酵母EC1118和2323，分別研究了不同檸檬酸濃度，pH條件和檸檬酸根濃度的培養條件下兩種釀酒酵母的生長曲線，以期揭示檸檬酸對釀酒酵母生長抑制的機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）EC1118與2323：法國萊蒙特集團；蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：美國OXOID公司；檸檬酸、強氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養基：1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。固體斜面培養基添加2%瓊脂。

1.2 儀器與設備

722N型紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；ZWF-2112恒溫培養振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；HH-6電熱數顯恒溫水浴鍋：上海安普科學儀器有限公司；5415D高速離心機：德國Eppendorf公司；徠卡DM1000顯微鏡：德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

分別稱取活性干酵母EC1118和23235.0g于燒杯中，加入2%葡萄糖溶液50 mL，在28℃恒溫培養箱中保溫30 min，離心收集細胞（4 000 r/min、5 min、4℃），用滅菌的生理鹽水清洗兩次。將收集的細胞分別接種到固體斜面培養基上，28℃恒溫培養48 h后于4℃冰箱中冷藏備用。

1.3.2 種子培養

挑取3環經活化的固體斜面酵母EC1118與酵母2323分別接種至250 mL搖瓶（裝液量50 mL的YPD液體培養基），28℃、120 r/min培養24 h。

1.3.3 檸檬酸對酵母生長的影響

在YPD液體培養基中，分別添加0、0.02mol/L、0.10mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L和0.40 mol/L檸檬酸，于裝液量為30 mL/250 mL的搖瓶中，滅菌（115℃、20 min）；分別接入1%的釀酒酵母EC1118與2323，置于28℃恒溫培養箱中培養，搖床轉速120 r/min，每隔3 h取樣，分別考察兩種酵母菌在不同檸檬酸濃度的YPD培養基中的生長情況。實驗重復3次。

1.3.4 pH值對酵母生長的影響

在YPD液體培養基中添加1 mol/L的HCl，調節培養基初始pH值至7.00、4.50、3.33、2.83、2.63、2.45；添加0、0.02mol/L、0.10 mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L和0.40 mol/L檸檬酸調節培養基初始pH值至7.00、4.50、3.33、2.83、2.63、2.45；于裝液量為30 mL/250 mL搖瓶，滅菌（115℃，20 min）；分別接入1%的釀酒酵母EC1118與2323，置于28℃恒溫培養箱中，搖床轉速120 r/min，每隔3 h取樣，分別考察兩種酵母菌在不同pH條件下的生長情況。實驗重復3次。

1.3.5 檸檬酸根對酵母生長的影響

在YPD液體培養基中，分別添加0.02mol/L、0.10mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L和0.40 mol/L檸檬酸，用5 mol/L NaOH溶液將培養基pH調至4.50，于裝液量為30 mL/250 mL搖瓶，滅菌（115℃，20 min）；分別接入1%的釀酒酵母EC1118與2323，置于28℃恒溫培養箱中培養，搖床轉速120 r/min，每隔3 h取樣，以未加檸檬酸為對照組，分別考察兩種酵母菌在不同濃度檸檬酸根條件下的生長情況。實驗重復3次。

1.3.6 分析測定

取培養的液體種子1 mL置于試管中，用生理鹽水進行適度稀釋，在波長600 nm處比色測定吸光度值，并在顯微鏡下用血球計數板計算酵母濃度（CFU/mL），建立吸光度值與酵母濃度的回歸方程。按照回歸方程計算菌體濃度。

2 結果與分析

2.1 菌體濃度與吸光度值的關系

吸光度值與酵母濃度的回歸方程，結果如圖1所示。

圖1 吸光度值與菌體濃度的相關性Fig.1 The correlation between absorbance value and cell count

由圖1可知，吸光度值與酵母濃度的回歸方程為Y=6.685 4X+0.114 2，相關系數R2=0.990，表明在0.2～0.8范圍內吸光度值與酵母濃度線性關系良好。

2.2 檸檬酸對釀酒酵母生長的影響

在果酒釀造過程中，釀酒酵母會面臨果實中有機酸尤其檸檬酸的脅迫[24-25]；本實驗從5種釀酒酵母中篩選了兩種具有代表性的菌種釀酒酵母EC1118和釀酒酵母2323，分別考察了檸檬酸添加量（0.02～0.4 mol/L）對兩種酵母生長的影響，結果見圖2。

圖2 檸檬酸添加量對釀酒酵母EC1118（A）與2323（B）生長的影響Fig.2 Effect of citric acid addition on the growth ofS.cerevisiae EC1118(A)and 2323(B)

由圖2A可知，不同濃度檸檬酸對2種酵母生長規律的影響是不同的；檸檬酸添加量＜0.10mol/L時，對酵母EC1118的生長影響不大，遲滯期為3 h，對酵母菌生長具有一定的促進作用，分析原因可能是低濃度檸檬酸作為碳源進入三羧酸循環被酵母生長利用[26-27]；檸檬酸添加量增至0.20 mol/L時，酵母EC1118的生長受到抑制，菌體數量略有降低。檸檬酸添加量增至0.30 mol/L時，酵母EC1118的生長明顯受到抑制，遲滯期延長至9 h，培養基中最大菌數明顯減少；酵母EC1118在檸檬酸添加量0.40 mol/L的培養基中幾乎停止生長。

由圖2B可知，與未添加檸檬酸的釀酒酵母2323相比，培養基中添加檸檬酸（0.02～0.40 mol/L）后，酵母菌2323的生長明顯受到抑制，延滯期延長，生長速率下降。檸檬酸添加量在0.02～0.10 mol/L范圍內，酵母菌數量略有下降；當檸檬酸添加量增至0.40 mol/L時，酵母菌仍能緩慢生長，但生長受到明顯抑制，酵母菌數量明顯降低。結果表明，添加檸檬酸對不同酵母菌生長的影響是不同的，低濃度檸檬酸對酵母EC1118生長有一定促進作用，高濃度檸檬酸會抑制釀酒酵母的生長，隨著檸檬酸添加量的不斷增加，酵母生長受到的抑制程度也逐漸增加。

2.3 pH值對釀酒酵母生長的影響

檸檬酸屬有機酸，培養基中添加檸檬酸會影響其初始pH值，會影響酵母菌的生長[6]。為進一步分析檸檬酸對釀酒酵母影響的機制，設計用鹽酸調節培養基初始pH值分別至不同檸檬酸濃度對應的pH值，結果如圖3所示。

圖3 pH值對釀酒酵母EC1118（A）與2323（B）生長的影響Fig.3 Effect of pH on the growth ofS.cerevisiaeEC1118(A)and 2323(B)

由圖3A可知，隨著pH值的降低，釀酒酵母EC1118生長抑制程度明顯增強，菌體數量逐漸降低；當pH值為7.00與4.50時，酵母菌EC1118生長速率較接近；當pH≤2.80時，酵母EC1118生長受到明顯抑制，表明酵母EC1118能夠適應3.30～7.00的pH范圍，低pH環境會明顯抑制酵母生長。由圖3B可知，pH值為7.00時的生長速率明顯高于其他pH條件下的生長速率，初始pH在2.45～4.50條件下時，酵母2323生長速率較接近，在低pH條件下酸性環境部分抑制其生長，此研究結果與檸檬酸對應pH條件下的生長規律明顯不同。由此可以看出，在相同pH條件下，不同種類的酸對釀酒酵母生長的抑制效應是不同的，高濃度檸檬酸對釀酒酵母的抑制效應可能不單獨是由電離出的氫離子毒性引起的。

2.4 檸檬酸根對酵母生長的影響

為避免培養基中添加檸檬酸后溶液的低pH值對酵母生長產生抑制效應，用NaOH溶液將培養基pH值分別調至4.50，考察酵母EC1118和2323的生長規律，結果如圖4所示。

圖4 檸檬酸根濃度對釀酒酵母EC1118（A）與2323（B）生長的影響Fig.4 Effect of citrate concentration on the growth ofS.cerevisiae EC1118(A)and 2323(B)

由圖4A可知，與未添加檸檬酸的對照組相比，當檸檬酸根濃度為0.02 mol/L時，促進了酵母EC1118的生長。當檸檬酸根濃度分別為0.10 mol/L、0.20 mol/L、0.30 mol/L時，酵母EC1118的生長受到抑制，當濃度增加至0.40 mol/L時，酵母EC1118幾乎停止生長，與未回調pH值的酵母生長呈現類似的規律。低濃度檸檬酸根（0.2 mol/L）能夠促進酵母EC1118的生長，其可以作為碳源，進入三羧酸循環，被酵母生長利用。

由圖4B可知，與未添加檸檬酸的對照組相比，添加不同濃度檸檬酸（0.02～0.40 mol/L）再回調pH至4.5后，酵母2323生長受到明顯抑制，與直接添加不同濃度檸檬酸呈現類似的規律。隨著檸檬酸根濃度的增加，對酵母2323生長抑制效應逐漸增加；當檸檬酸根濃度為0.4 mol/L時，酵母2323的生長基本停滯。分析原因可能是檸檬酸是較強的有機酸，在溶液中電離出部分氫離子和檸檬酸根離子，檸檬酸根離子能夠螯合培養基中的鈣離子、鎂離子等金屬離子，進一步抑制酵母的生長[22]。

檸檬酸在液體培養基中會電離出部分氫離子，引起培養基pH降低，改變酵母的生長環境[28]，從而影響酵母的生長；電離出的部分檸檬酸根離子會螯合培養基中的金屬離子，影響酵母生長所必需的金屬離子[29-30]，同時會打破檸檬酸電離平衡而電離出更多氫離子，進一步抑制酵母的生長。因此，液體培養基中高濃度檸檬酸對微生物生長的抑制效應是氫離子和檸檬酸根的疊加影響。

3 結論

研究了S.cerevisiaeEC1118與2323在不同檸檬酸濃度、pH值和檸檬酸根培養條件下的生長規律。高濃度檸檬酸（0.10～0.40 mol/L）會抑制兩種釀酒酵母生長，pH值≤2.80時，釀酒酵母的生長均受到抑制。其抑制效應是檸檬酸根與氫離子的疊加效果，且檸檬酸根的影響占主導。本研究為進一步解除有機酸對釀酒酵母抑制效應以及創制新型果酒提供一定理論依據。

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