產柚苷酶黑曲霉SL2K發酵條件優化

伍玉春，陳顯玲，蘇 龍*

（1.燕京啤酒（玉林）有限公司，廣西 玉林 537000；2.玉林師范學院 生物與制藥學院，廣西 玉林 537000；3.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，廣西 玉林 537000）

柚子（Citrus grandisosbeck）又名文旦、香拋、雷柚、氣柑，俗稱團圓果，屬蕓香科柑橘屬，為蕓香科植物常綠果樹柚樹的成熟果實[1]。作為柚子主要產地的廣西玉林容縣，主要品種為沙田柚，經過幾十年的發展，栽培面積達18萬畝，年產量12萬t[2]。柚子目前主要以鮮食和現榨果汁食用為主，但隨著種植規模的擴大，現行的消費方式已經不合適，造成柚子的大量積壓、壞果、浪費，深加工是必然之路。雖然目前也有一些柚子深加工的研究報道，如柚子果汁飲料[3-5]、酒類制品[6-7]、茶制品[8-10]、蜜餞果脯類制品[11-12]、果醋制品[13]，但大部分還不能實現市場化、規模化。柚子的加工利用不足的一個主要原因就是柚子果實在加工過程中苦味難以去除，過重的苦味降低了柚子的品質和價值，這也是柑桔果實加工業的主要問題。柚子的苦味是因為柚皮及囊瓣中含有較多的柚皮苷等一些苦味成分引起的，曾有報道采用不同方法進行脫苦試驗，如環糊精屏蔽脫苦、超臨界CO2脫苦、膜脫苦、代謝脫苦、吸附脫苦等[14-17]，但脫苦效果均不佳，未從根本上得到解決。從目前的發展趨勢來看，酶法脫苦具有專一性強，對柑橘果汁風味和營養成分破壞少、效果好、成本低等特點，是柑橘類果汁脫苦最有潛力和應用價值的方法，如劉棠等[18]利用柚苷酶處理柚子果汁，對其酶解條件進行了研究，發現經過柚苷酶處理的柚子果汁，檸檬苦素去除率達到78%；黃穎穎等[19]利用柚苷酶對琯溪蜜柚果汁進行脫苦工藝的優化，柚皮苷和檸檬苦素的去除率分別達到90.25%和87.09%；陳紅等[20]利用棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）JMUdb058固態發酵產生的柚苷酶處理柚子果汁，柚皮苷的去除率達到99.6%。柚苷酶的來源廣泛，植物、動物和微生物均有。目前柚苷酶的主要來源為微生物，含有柚苷酶的微生物有細菌[21-22]、酵母[23]，其中真菌（曲霉和青霉）來源的柚苷酶最多[24-30]。雖然國內已有柚苷酶菌株的篩選及應用的相關報道，但是作為一種具有重要應用價值的酶，還有一些問題有待于解決，如現有的柚苷酶產生菌的產酶水平較低，生產成本過高；柚苷酶的結構、功能和酶的穩定性差等。

柚苷酶能將柚類果汁的苦味物質分解為無苦味物質，具有非常重要的經濟價值。本實驗室從天然發霉的柚子皮中分離、篩選到一株能高效生產胞外柚苷酶的菌株，根據菌體形態和ITS序列分析，初步鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）SL2K。本研究采用單因素和正交試驗對黑曲霉（Aspergillus niger）SL2K產柚苷酶的液體發酵條件進行優化，以提高黑曲霉（Aspergillus niger）SL2K產柚苷酶能力，為該酶的進一步開發利用奠定基礎，并對玉林沙田柚乃至柑桔類果實的深加工產生重大影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實驗菌株黑曲霉（Aspergillus niger）SL2K：本實驗室分離保藏。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（NaOH）（分析純）：天津市博迪化工有限公司；柚皮苷（純度98.0%）：西安匯林生物科技有限公司；鼠李糖（純度98.0%）：西安匯林生物科技有限公司；蛋白胨、牛肉膏（均為生化試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司；其他試劑（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

查氏培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，蔗糖30g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，加熱溶解，分裝后于115℃滅菌30 min。

產酶基礎培養基：NaNO32 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO·47H2O 0.5 g/L，FeSO40.01 g/L，蔗糖 30 g/L，pH值自然，分裝后121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Tu21800紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HH-s數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市醫療儀器廠；FE20 Five Easy實驗室pH計、AL204電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。IS-RDS3型恒溫搖床：上海智誠儀器有限公司；SPX-15OB-Z型生化培養箱：上海博訊實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產酶液體發酵

種子液：將保藏的黑曲霉SL2K接種至查氏培養基，于30℃培養箱培養5 d，在超凈工作臺內用10 mL無菌水洗脫菌株孢子，制備菌懸液，孢子濃度為1×108CFU/mL。

液體發酵：按接種量8%接入裝液量為100 mL/250 mL的發酵培養基中，于28℃、180r/min振蕩培養96h。

1.3.2 柚苷酶活的測定[24]

（1）柚皮苷標準曲線的制作

將柚皮苷標準品在110℃下干燥至恒質量，稱取0.100g，添加0.1 mol/L的NaOH溶液20.0 mL使其完全溶解后，用20%檸檬酸調節pH值至6.0，用去離子水定容至100 mL，得柚皮苷標準液。精確吸取柚皮苷標準液0、0.5mL、1.0mL、1.5 mL、2.0 mL于5支試管中，加0.2 mol/L pH值為4.0的醋酸緩沖液1.9 mL，分別在每支試管中添加蒸餾水至總體積為4.0 mL，充分混合均勻后吸取0.1 mL的混合液，置于新的試管中，再添加體積分數90%的二甘醇5.0 mL和1 mol/L NaOH 0.5 mL以及0.4 mL的蒸餾水，搖勻放置在40℃的恒溫水浴鍋中進行顯色反應15 min，后在波長420 nm處測定其吸光度值A420nm，以吸光度值（y）為縱坐標，柚皮苷質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線。

（2）粗酶液制備

發酵液經8 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為即粗酶液。

（3）柚苷酶活力的測定

采用戴維斯法測定柚苷酶活力[25]。配制濃度為0.1%的柚皮苷標準液，同時配制濃度為1 mol/L的NaOH溶液和濃度為0.2 mol/L pH 4.0的醋酸緩沖液。取適量的柚苷酶粗酶液，采用pH 4.0的醋酸緩沖液稀釋若干倍后，備用。取2 mL柚皮苷標準液和1.9 mL醋酸緩沖液在恒溫水浴鍋中40℃預熱4～5 min，然后加入0.1 mL稀釋后的柚苷酶粗酶液，置于試管中，在40℃的恒溫水浴鍋中準確保溫30 min后，添加體積分數90%的二甘醇5.0 mL、1 mol/L NaOH 0.5 mL以及0.4mL的蒸餾水，放置在40℃的恒溫水浴鍋中進行顯色反應15min，顯色完成后立即在波長420 nm處測定其吸光度值。根據柚皮苷標準曲線，計算得剩余柚皮苷的含量，與總的柚皮苷含量進行作差比較，求出酶解的柚皮苷含量（μg）。

柚苷酶活力定義：在pH4.0、40℃的條件下，柚苷酶每分鐘水解1μg柚皮苷所需要的酶量為一個活力單位（U/mL）。

1.3.3 單因素試驗

以柚苷酶活力為指標，分別考察添加量為3%的碳源種類（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麩皮粉、玉米粉、柚子皮粉）、碳源添加量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）、添加量為2%的氮源種類（硫酸銨、尿素、硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、黃豆粉）、氮源添加量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）、誘導物（鼠李糖）添加量（0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%）、接種量（4%、6%、8%、10%、12%）、初始pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、發酵時間（24h、48h、72h、96h、120h、144h）對黑曲霉SL2K產柚苷酶的影響。

1.3.4 正交試驗設計產酶條件優化

在單因素試驗的基礎上，選取影響較大的4個因素，進行4因素4水平正交試驗設計L16（44），正交試驗因素與水平見表1。

表1 產酶條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzyme production conditions optimization

2 結果與分析

2.1 柚皮苷標準曲線繪制

根據1.3.2的方法制作標準曲線，以柚皮苷含量（x）為橫坐標，在波長420 nm處所測得樣品的吸光度值（y）A420nm為縱坐標，柚皮苷標準曲線如圖1所示。由圖1可知，柚皮苷的標準曲線回歸方程為y=0.000 2x+0.002 9，相關系數為R2=0.999 7，說明吸光度值與柚皮苷含量之間具有良好的線性關系。

圖1 柚皮苷的標準曲線Fig.1 Standard curve of naringin

2.2 單因素優化結果

2.2.1 不同碳源對產酶的影響

采用產酶基礎培養基，加入相同濃度（添加量3%）不同的碳源配制培養基，于28℃、180 r/min條件下培養96 h，以考察不同的碳源對產酶的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，當以麩皮粉為碳源時，柚苷酶活力最高，達到210.57U/mL；當以可溶性淀粉、玉米粉為碳源時，酶活力次之，分別為170.39 U/mL、188.35 U/mL；而當以蔗糖、葡萄糖及柚子皮粉為碳源時，酶活力較低（分別為144.23U/mL、151.31 U/mL及142.46 U/mL）；因此，采用麩皮粉作為培養基碳源。

圖2 不同碳源對產酶的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on naringinase production

2.2.2 麩皮粉添加量對產酶的影響

在上述試驗的基礎上，考察麩皮粉添加量對產酶的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同麩皮粉添加量對產酶的影響Fig.3 Effects of different bran powder addition on naringinase production

由圖3可知，當麩皮粉添加量在1%～3%范圍內時，隨著麩皮粉添加量的增加，所產酶活力逐漸提高，酶活從169.27 U/mL提高到224.37 U/mL；當麩皮粉添加量達到3%時，酶活力達到最高，為224.37U/mL；當麩皮粉添加量＞3%之后，酶活力逐漸降低。因此，本試驗選擇麩皮粉最佳用量為3%。

2.2.3 不同氮源對產酶的影響

圖4 不同氮源對產酶的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on naringinase production

在確定最佳碳源及碳源濃度的基礎上，加入相同濃度（添加量2%）的不同氮源配制培養基，以考察氮源對產酶的影響，結果如圖4所示。

由圖4可知，當以硝酸鈉、硫酸銨及尿素為氮源時，酶活力較低（分別為101.39U/mL、112.98U/mL及123.56 U/mL）；當以蛋白胨為氮源時，酶活力最高，達到206.91 U/mL；當以酵母膏、黃豆粉作為氮源時，酶活力分別為180.69 U/mL、162.46 U/mL。因此，選擇蛋白胨作為最佳氮源。

2.2.4 蛋白胨添加量對產酶的影響

在上述試驗的基礎上，考察蛋白胨添加量對產酶的影響，結果如圖5所示。

圖5 不同蛋白胨添加量對產酶的影響Fig.5 Effects of different peptone additions on naringinase production

由圖5可知，當蛋白胨添加量為1%～5%范圍內時，隨著蛋白胨添加量的增加，所產酶活力逐漸提高；當蛋白胨添加量為5%時，微生物產酶能力最強，酶活達到226.91 U/mL；當蛋白胨添加量＞5%之后，產酶能力有所下降。因此，本試驗選擇最佳蛋白胨添加量為5%。

2.2.5 誘導物對產酶的影響

調節不同的鼠李糖含量，以考察誘導物對產酶的影響，結果如圖6所示。

圖6 誘導物添加量對產酶的影響Fig.6 Effects of different inducer addition on naringinase production

由圖6可知，當誘導物含量在0～0.08%范圍內時，隨著誘導物含量的增加，菌株產酶能力逐漸增強；當誘導物含量為0.08%時，菌株產酶能力最強，酶活達到251.35 U/mL；當誘導物含量＞0.008%之后，產酶能力逐漸減弱。因此，本試驗選擇誘導物鼠李糖添加量為0.08%。

2.2.6 培養基初始pH值對產酶的影響

調節不同的初始pH值，以考察初始pH值對產酶的影響，結果如圖7所示。

圖7 不同初始pH值對產酶的影響Fig.7 Effects of different initial pH value on naringinase production

由圖7可知，初始pH值為2.0～5.0范圍內時，菌株產酶能力隨初始pH值增大逐漸增強，酶活從118.31 U/mL提高到222.35 U/mL；當初始pH值為5.0時，菌株產酶能力最強，為222.35 U/mL；當初始pH值＞5.0之后，產酶能力逐漸減弱。因此，本試驗選擇5.0為最佳初始pH值。

2.2.7 接種量對產酶的影響

接種不同濃度的種子液，以考察接種量對產酶的影響，結果如圖8所示。

圖8 不同接種量對產酶的影響Fig.8 Effects of different inoculum on naringinase production

由圖8可知，當接種量在2%～8%范圍內時，酶活隨著接種量的增大而增加；當接種量為8%時，酶活最高，為193.03 U/mL；當接種量＞8%之后，酶活反而降低。分析原因可能是隨著接種量的增加，菌種快速增殖，進入主發酵期，加快酶的分泌；但接種量過高時，培養基營養成分消耗過快，菌種老化速度也將加快，最終酶的分泌量也會減少。因此，最佳接種量為8%。

2.2.8 培養時間對產酶的影響

不同的培養時間對產酶的影響，結果如圖9所示。

圖9 培養時間對產酶的影響Fig.9 Effects of culture time on naringinase production

由圖9可知，在培養24～48h范圍內，柚苷酶的酶活非常低，分別為18.31U/mL、33.56U/mL，分析原因可能是由于菌株剛開始增殖，產酶量少；隨著培養時間在48～96h內延長，酶活逐漸增大；當培養96 h時，酶活最高，為203.02 U/mL；繼續延長培養時間，當培養時間＞96 h之后，酶活略微下降，分析原因可能是，隨著培養時間的延長，培養基中的營養成分逐漸減少，有害代謝副產物不斷分泌，培養環境已經不適應菌體的生長和酶的分泌，導致產酶下降。因此，選擇96 h為最佳培養時間。

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，以柚苷酶活力（Y）為考察指標，選取麩皮粉添加量（A）、蛋白胨添加量（B）、初始pH值（C）及接種量（D）4個因素，進行4因素4水平正交試驗，采用L16（44）正交試驗表進行設計并試驗，結果與分析見表2，方差分析結果見表3。

表2 產酶條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for enzyme production conditions optimization

續表

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，對黑曲霉產柚苷酶的影響因素主次順序為A＞B＞C＞D，即麩皮粉添加量＞蛋白胨添加量＞接種量＞初始pH值。產柚苷酶發酵條件的最佳組合為A2B3C2D3，即麩皮粉添加量3%、蛋白胨添加量5%、接種量8%、初始pH值5.0。在此最優發酵條件下進行3次驗證試驗，柚苷酶酶活達到233.89 U/mL，是優化前酶活力的2.13倍。

由表3可知，在選取的4個因素中，麩皮粉添加量和蛋白胨添加量對結果影響極顯著（P＜0.01），接種量對結果影響顯著（P＜0.05），初始pH值對結果影響不顯著（P＞0.05）。3結論

本研究通過單因素及正交試驗，對黑曲霉SL2K液態發酵產柚苷酶的發酵條件進行優化，得到最佳產酶條件為麩皮粉添加量3%、蛋白胨添加量5%、接種量8%、初始pH值5.0、鼠李糖 0.08%、KH2PO41 g/L、KCl 0.5 g/L MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO40.01g/L。28℃、180r/min、培養96h。在最優發酵條件下，柚苷酶活力從110.02 U/mL增加到233.89 U/mL，是優化前的2.13倍。柚苷酶應用于食品工業，特別是柑桔類及其他制品的脫苦與加工在國外已有相關報道，但我國柚苷酶并沒有在工業生產中大規模應用，整體而言，柑橘類果汁苦味去除的研究還處于實驗室階段。加強關于柚苷酶高產菌株的選育及發酵工藝的優化等基礎研究工作，選育出活性高、產酶量大的優良菌株，柚苷酶在食品工業中將得到更好的應用。同時柚皮苷及其分解產物作為重要醫藥化工的中間體，具有抗炎、抗癌、抗菌等功能，在醫藥領域具有潛在價值[30]。

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