響應面法優化榿葉唐棣果酒發酵工藝的研究

曹麗娟，張卓睿，王 傍，薛艷麗，毛迪銳，孟慶繁，姜貴全*

（北華大學 林學院，吉林 吉林 132013）

榿葉唐棣（Amelanchier alnifoliaNutt）是薔薇科唐棣屬落葉植物[1]，果實中鈣含量高（88 mg/100 g鮮果），也稱高鈣唐棣[1-2]，其所含營養成分與藍莓非常相似，具有抗氧化[3-4]、降血糖[5]、降血脂[6]、預防癌癥[7]等功效。

果酒是將水果經酵母菌發酵而制得的一類低度飲料酒[8-9]，富含氨基酸、多糖、多酚、維生素等成分[10-11]，同時，由于在釀造過程形成了醇類、醛類、酯類等物質，也賦予了果酒一些原料所不能及的營養及風味，具有較好的保健作用，可起到控制膽固醇、促進血液循環、調節新陳代謝、抗衰老、美容養顏等功效[12-13]。近年來，隨著人們保健意識的增強，果酒需求量逐年增大，因此，研發一些新產品以豐富果酒市場、滿足不同消費需要已成為研究的新熱點[14]。榿葉唐棣果實為梨果狀漿果，呼吸強度高，耐貯性較差[15]，而目前國內對其果實的加工能力不足，產品品種少，貯運技術不完善，造成了資源的浪費。所以，本試驗將榿葉唐棣發酵釀制成一種含鈣果酒，不但符合果酒市場的發展趨勢，滿足當代人群對補鈣食品的需求，而且可以減少榿葉唐棣果實在運輸、貯藏過程中的損耗，提高原料附加值，對促進其開發利用起到積極的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

安琪果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；蔗糖（食品級）：市售；亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

榿葉唐棣：采于吉林蛟河林場，清洗后冷凍貯藏。

1.2 儀器與設備

HH-2數顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市科技儀器有限公司；LDZX-40Ⅱ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；RHB80手持式糖量折光儀：泰斯特儀器有限公司；SPX-2500S-Ⅱ型生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 榿葉唐棣果酒制作工藝流程

1.3.2 操作要點

原料預處理：選擇無病蟲害、無霉爛腐爛、成熟度好的榿葉唐棣果實，清洗、瀝干后，將唐棣果充分破碎。

成分調整：將唐棣果漿調整至最適糖度，并添加亞硫酸氫鈉（以SO2計65～80 mg/kg）。

滅菌：將調整成分后的果漿在80℃條件下加熱15～20 min，以達到滅菌及滅酶的效果。

活化酵母：按1∶10將果酒酵母和3%蔗糖溶液混合，輕微攪拌后，35℃下保溫25 min[16]。

發酵：按最佳工藝條件，向唐棣果漿中加入0.06%活化酵母，攪拌均勻后，25℃發酵12 d。

過濾與陳釀：用200目濾布將發酵好的唐棣果酒過濾，然后在18～20℃陳釀2個月。

巴氏殺菌：陳釀后果酒在70～75℃保持15～20 min。

1.3.3 發酵工藝優化單因素試驗

以酒精度為主要評定指標，分別考察發酵溫度（18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃），酵母接種量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%），初始糖度（12%、14%、16%、18%、20%、22%），發酵時間（5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d）對榿葉唐棣果酒發酵的影響。

1.3.4 響應面試驗優化發酵工藝

在單因素試驗基礎上，固定榿葉唐棣果漿初始糖度為22%，以酵母接種量（A），發酵溫度（B），發酵時間（C）為考察因素，以酒精度（Y）為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計[17]，以優化發酵工藝。因素與水平編碼見表1所示。

表1 發酵工藝優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation technology optimization

1.3.5 果酒品質分析

（1）感官指標

表2 榿葉唐棣果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards ofAmelanchier alnifoliafruit wine

參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中感官分析設計評分方法對榿葉唐棣果酒進行感官評價，滿分為100分，感官評分標準見表2。

（2）理化指標

酒精度：酒精比重計法[11]；糖度：折光計法[11]；總糖（以葡萄糖計）測定：直接滴定法[18]；鈣的測定：原子吸收分光光度法[19]。

（3）微生物指標

菌落總數、大腸桿菌及致病菌（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）按GB/T 4789.25—2003《食品衛生微生物學檢驗酒類檢驗》的規定執行[20]。

2 結果與分析

2.1 發酵溫度對榿葉唐棣果酒的影響

調整榿葉唐棣果漿初始糖度為18%，接入0.06%活化后酵母，分別于18℃、21℃、24℃、27℃、30℃、33℃條件下恒溫發酵7 d，測得酒精度如圖1所示。

圖1 發酵溫度對榿葉唐棣果酒酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on alcohol content of Amelanchier alnifoliafruit wine

由圖1可知，隨著發酵溫度的升高，產品酒精度先逐漸增大，當發酵溫度為24℃時，果酒酒精度達到最大值為9.2%vol；之后繼續升高發酵溫度，酵母衰老加速，活性受到抑制，酒精度開始緩慢下降，而且所得果酒逐漸呈現出苦味，口感變差。因此，確定適宜的發酵溫度為24℃。

2.2 酵母接種量對榿葉唐棣果酒的影響

調整榿葉唐棣果漿初始糖度為18%，分別按0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%接入活化后酵母，于24℃恒溫發酵7 d后，測定各試驗點酒精度，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著酵母接種量的增加，酒精度先快速升高，當接種量為0.06%時，果酒酒精度達到最大值9.9%vol，之后繼續增加接種量，由于果漿中糖分過多的用于酵母菌的生長繁殖，反而不利于發酵，酒精度開始下降，同時酒體含糖下降，酸度升高，口感變差。因此，選擇適宜的酵母接種量為0.06%。

圖2 酵母接種量對榿葉唐棣果酒酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content of Amelanchier alnifoliafruit wine

2.3 初始糖度對榿葉唐棣果酒的影響

分別調整榿葉唐棣果漿初始糖度為16%、18%、20%、22%、24%、26%，接入0.06%活化后酵母，于24℃恒溫發酵7 d后測定酒精度，結果如圖3所示。

圖3 初始糖度對榿葉唐棣果酒酒精度的影響Fig.3 Effect of initial sugar content on alcohol content of Amelanchier alnifoliafruit wine

由圖3可知，隨著初始糖度的升高，酒精度先增加后減小，當初始糖度為22%時，果酒酒精度達到最大值11.8%vol；當初始糖度高于24%以后，過高的滲透壓會抑制果酒酵母的活性，不利于發酵，酒精度開始下降，而且過多的糖分會導致產品口感偏甜，降低果酒的品質。因此，選擇適宜初始糖度為22%。

2.4 發酵時間對榿葉唐棣果酒的影響

調整榿葉唐棣果漿糖度為22%，接入0.06%活化后酵母，于24 ℃分別發酵5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d后測定酒精度，結果如圖4所示。

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，果酒酒精度呈先增加后略降低的趨勢，當發酵時間為11 d時，果酒酒精度達到最大值13.2%vol，此時酒香協調，口感較好；之后再延長發酵時間，產品酒精度和口感變化不大，適于陳釀。因此，選擇適宜的發酵時間為11 d。

圖4 發酵時間對榿葉唐棣果酒酒精度的影響Fig.4 Effect of fermentation time on alcohol content of Amelanchier alnifolia fruit wine

2.5 響應面試驗優化發酵工藝

以酵母接種量（A），發酵溫度（B），發酵時間（C）為考察因素，以酒精度（Y）為響應值，進行響應面試驗設計，試驗結果見表3，方差分析見表4。

表3 發酵工藝優化響應面試驗設計與結果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation technology optimization

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中的試驗結果進行回歸擬合，得到榿葉唐棣果酒的酒精度（Y）對應酵母接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）的回歸方程為：

由表4可知，回歸模型檢驗P＜0.000 1，表明方差分析所建數學模型極顯著，在統計學上是有意義的；失擬項檢驗P=0.668 1＞0.05，差異不顯著，說明試驗結果受未知因素干擾小，可用回歸方程代替真實點對試驗結果進行分析；變異系數（coefficientofvariation，CV）＝1.45%值較低，表明試驗精確度較高，結果真實可靠[21]；精密度為20.301＞4，表明方程的可信度較高[17]；決定系數R2=0.984 2，表明方程的擬合度較好[17]。綜上所述，可確定所得回歸方程能用于優化榿葉唐棣果酒的發酵工藝。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

根據回歸方程一次項系數絕對值的大小，可知影響榿葉唐棣果酒酒精度的主次因素為發酵溫度（B）＞發酵時間（C）＞接種量（A），其中發酵溫度（P＜0.000 1）和發酵時間（P=0.004 2＜0.01）是極顯著因素，說明它們對榿葉唐棣果酒的發酵影響較大，而接種量（P=0.014 5＜0.05）是顯著因素，說明酵母接種量對唐棣果酒發酵也有影響，但程度不如前兩者。3個因素交互作用的響應曲面見圖5所示。

由圖5可知，試驗點范圍內酒精度產生了最大值，說明各因素所選水平合理，能反映出彼此間交互作用對唐棣果酒發酵的影響趨勢。其中發酵時間與酵母接種量交互作用（P=0.001 4＜0.01）對唐棣果酒發酵影響極顯著，交互作用的三維曲面比較陡峭，相應等高線呈橢圓形；而發酵溫度與酵母接種量（P=0.014 8＜0.05）、發酵溫度與發酵時間（P=0.010 3＜0.05）的交互作用響應曲面等高線略趨變圓，曲面較平滑，說明它們對酒精度的影響要低于前者。

通過響應面試驗優化，得出榿葉唐棣果酒的最佳發酵工藝條件為酵母接種量0.06%，發酵溫度25.05℃，發酵時間11.58 d，對應酒精度理論值為14%vol，為方便操作將條件修正為酵母接種量0.06%，發酵溫度25℃，發酵時間12 d，按此條件進行3次平行驗證試驗，測定唐棣果酒的酒精度平均值為14.7%vol，與預測值基本吻合。所得榿葉唐棣果酒澄清透明，呈寶石紅色，口感香醇，酒香清晰，具有榿葉唐棣風味，典型性突出，測定其鈣含量為29.71 mg/100 mL，菌落總數≤10CFU/mL，大腸菌群數≤2MPN/100mL，致病菌（沙門氏菌、金黃色葡萄球菌）未檢出，符合國標GB 2758—2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》中相關要求[22]。

圖5 接種量、發酵溫度、發酵時間交互作用對酒精度影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum,fermentation temperature and time on alcohol content

3 結論

本研究通過對榿葉唐棣果酒發酵工藝條件進行分析，確定了發酵溫度和發酵時間是影響果酒品質的兩個關鍵性因素，采用響應面試驗得到了榿葉唐棣果酒的最佳發酵工藝條件為初始糖度22%，酵母接種量0.06%，發酵溫度25℃，發酵時間12 d。在此優化條件下，所得果酒呈明亮的寶石紅色，口感香醇，具有清晰的榿葉唐棣風味，典型性突出。成品酒中鈣含量為29.71mg/100mL，菌落總數≤10CFU/mL，大腸菌群數≤2 MPN/100 mL，致病菌未檢出，符合國標GB 2758—2012《食品安全國家標準發酵酒及其配制酒》中相關要求[22]。本研究不但研發出了一種營養、風味俱佳的新型果酒，豐富了果酒市場產品類別，而且有助于進一步了解榿葉唐棣的品質及引種價值，拓展了開發思路，避免了資源的浪費和應用產品的單一化，具有一定的研究價值及意義。

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