藜蒿總黃酮生物轉化菌株的篩選及轉化工藝優化

李 寧，葉子茂，向 福，3*，韓 羞，周昭宏，何 峰，3

（1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，湖北 黃岡 438000；2.黃岡師范學院 生命科學學院，湖北 黃岡438000；3.大別山特色資源開發湖北省協同創新中心，湖北 黃岡 438000）

藜蒿（Artemisia selengensis），菊科蒿屬草本植物，又名蔞蒿、水蒿、蘆蒿、水艾等，具特殊清香氣味，是藥食兩用的綠色健康蔬菜[1]。《本草綱目》中描述其“祛風寒濕痹”、“補中益氣，利膈開胃，療心懸”；《神農本草經》中記載藜蒿“久服輕身，耳聰目明，不老”；民間則以藜蒿全草入藥，具有清火消炎以及治療寒冷腹痛、急性肝炎、月經不調等功效，且安全無副作用[2]。現代研究表明[3-6]，藜蒿富含黃酮類、酚酸類、有機酸類、多不飽和脂肪酸類及氨基酸類等活性成分，尤其是黃酮類和酚酸類物質成分使其具有良好的抗氧化活性。

植物次生代謝產物的微生物轉化是近年來的研究熱點[7]，利用微生物轉化能大幅度提高具有生物活性的次生代謝產物含量，如槲寄生提取物經球形紅細菌轉化后，其總黃酮含量增加高達129%[8]，微生物轉化法在中藥和天然活性物質的開發及工業化應用方面具有廣闊的應用前景[9-11]。本實驗從藜蒿根際土壤中篩選轉化總黃酮的菌株，并對其發酵條件進行優化，從而為大別山富余藜蒿資源的綜合利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黎蒿根際土壤和藜蒿：采于湖北省黃岡市春陽蔬菜合作社種植基地；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京雙旋微生物培養基制品廠；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：上海山浦化工有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：上海新寶精細化工廠；蘆丁標準品（純度＞98%）：上海金穗生物科技有限公司。

營養瓊脂（nutrient agar，NA）液體培養基[12]：取3.0 g牛肉浸膏，5.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，1 L蒸餾水，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

FA2104電子分析天平：上海精細天平有限公司；GNP-9050隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；Cary-100紫外分光光度計：美國Varian公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋：北京西城區醫療器械廠；HYG-B全溫度搖瓶柜：太倉市實驗設備廠；SX-610型筆式pH計：上海三信儀表廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 土壤樣品的采集與稀釋液的制備

采用“S”形布點采樣確定5個采樣點[13]，依次采取0、5 cm、10 cm、15 cm和20 cm深處的土壤，并采取植株拔起后根部附帶的土壤，共6個土壤樣品。

準確稱取土壤樣品1 g，加入盛有9 mL無菌水的試管內，于搖床上200 r/min振蕩20 min，靜置，過濾，即得10-1土壤稀釋液。在超凈工作臺內，用移液槍吸取10-1土壤上清液1 mL移入裝有9 mL無菌水的離心管中，充分搖勻，即得10-2稀釋液，以同樣方法制取10-3、10-4、10-5、10-6和10-7土壤稀釋液。

1.3.2 菌株的分離純化

NA培養基平板分別涂上濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤稀釋液后，于37℃培養48 h，待其長出菌落后，挑選單菌落在新的NA培養基上劃線，直至得到純化單菌落，4℃保存備用。

1.3.3 菌株的篩選

參照文獻[14]方法，取藜蒿嫩葉所磨的粉末10 g加入200 mL蒸餾水，在70℃水浴鍋中加熱1 h后取出抽濾2次，得到藜蒿黃酮水提液。

取一環純化單菌落接種至300 mL/500 mL的NA液體培養基中，在30℃、150 r/min條件下培養24 h制成菌懸液，控制OD600nm值為0.7左右。取7個三角瓶，每瓶里分別倒入30 mL NA液體培養基和10 mL黃酮水提液，121℃滅菌30 min后在無菌環境下接入1 mL菌懸液，然后在30℃，150 r/min條件下培養72 h，測定其總黃酮含量。

1.3.4 菌株的生物學鑒定

將篩選并純化后的菌落，用革蘭氏染色法在油鏡下觀察其顯微形態及基本的生物學特性。

1.3.5 標準曲線制備及總黃酮含量測定

按照文獻[6]的方法，準確稱取20.0 mg蘆丁標準品，用體積分數60%乙醇溶液溶解并定容至200 mL，制得0.1 g/L的蘆丁標準液。準確吸取蘆丁標準液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和6 mL于25 mL容量瓶，蒸餾水為空白，分別加體積分數60%乙醇溶液5.5 mL，5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，用體積分數60%乙醇溶液定容，搖勻靜置15 min顯色。然后以空白為對照，于波長510nm處測定其吸光度值，以蘆丁標準品質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，擬合蘆丁標準曲線回歸方程為：y=0.029 1x-0.029，相關系數R2=0.999 2，表明蘆丁質量濃度在0.004～0.024 g/L范圍內與吸光度值線性關系良好。

樣液按照蘆丁標準曲線制備方法進行處理，并在波長510 nm處測定其吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算總黃酮含量，試驗重復三次。

1.3.6 菌株發酵工藝單因素試驗

取NA液體培養基30mL和黃酮水提液10mL置于250mL三角瓶，分別以不同的接種量（培養基∶菌懸液）（1 000∶1、100∶1、10∶1、2.5∶1、1∶3（V/V））、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、發酵時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h）和發酵溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）為變量因素，在150 r/min條件下搖床發酵不同時間（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h），考察接種量、初始pH、發酵溫度和發酵時間等因素對藜蒿總黃酮含量的影響。

1.3.7 響應面優化試驗

根據響應面法的Box-Behnken試驗設計原理，選取單因素試驗中影響顯著的因素發酵時間（X1）、接種量（X2）、初始pH（X3）為自變量，以總黃酮含量（Y）為響應值，設計3因素3水平的響應面優化試驗，如表1所示。

表1 發酵工藝條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization

1.3.8 數據分析

利用Microsoft Excel 2003和Design Expert 8.05等軟件進行試驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選結果及形態觀察

2.1.1 高效轉化藜蒿總黃酮菌株的篩選

從藜蒿根際土壤樣品中共分離得到6種不同菌株，即菌株1#、2#、3#、4#、5#、6#，除20 cm深處土壤樣品外，其他5種土壤均篩選到菌株，并測定其總黃酮含量，結果如表2所示。由表2可知，加入藜蒿黃酮水提液發酵后，各菌株發酵液中總黃酮含量變化差異明顯。其中，菌株1#發酵液中總黃酮含量顯著降低，達到19.88%（P＜0.05）；而菌株2#、3#、4#發酵液中總黃酮含量均顯著提高，增幅最大的為菌株4#，達到12.23%（P＜0.05）；菌株5#和6#發酵液中總黃酮增量分別呈小幅度的下降和增加，但均不顯著（P＞0.05）。因此，選擇菌株4#對藜蒿水提液中總黃酮進行轉化，此菌株來源于藜蒿根部附帶土壤樣品。

表2 高產黃酮的菌株篩選Table 2 Screening of high-yield flavonoids strains

2.1.2 菌株形態觀察

圖1 菌株4#的菌落形態(A)及細胞形態(B)Fig.1 Colonies(A)and cell morphology(B)of strain 4#

由圖1可知，菌株4#在NA培養基上培養48 h后，菌落呈圓形，乳白色，中間稍隆起，表面粗糙不透明；革蘭氏染色呈陽性，油鏡下觀察到菌株成細桿狀或短棒狀，與文獻[15-16]中芽孢桿菌屬形態特征一致，因此，初步鑒定其為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）菌株。

2.2 單因素試驗

2.2.1 初始pH值對總黃酮含量的影響

微生物的生長、酶的分泌以及酶催化反應均受pH環境的影響，過高或過低的pH會抑制菌體生長，會導致菌體內的酶受到抑制，酶催化速率降低[17-18]。

圖2 初始pH值對總黃酮含量的影響Fig.2 Effect of initial pH value on total flavonoids content

由圖2可知，當初始pH值由6.0增加到7.5時，總黃酮含量緩慢增加，在初始pH7.5時達到峰值，為14.32g/L，當初始pH值增加到8.0時，總黃酮含量則極顯著降低（P＜0.01）。因此，選擇初始pH值7.5為宜。

2.2.2 接種量對總黃酮含量的影響

圖3 接種量對總黃酮含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on total flavonoids content

由圖3可知，菌懸液接種量由1 000∶1（V∶V）增加到100∶1時總黃酮含量達到最高，為23.92 g/L，繼續增加接種量到10∶1（V∶V）時，總黃酮含量則顯著降低（P＜0.01），之后一直呈明顯的下降趨勢，到1∶3時降到最低。菌懸液接種量過大，菌體數量過多，導致菌株營養和溶氧不足，發酵能力反而下降[19-20]。因此，選擇接種量100∶1（V∶V）為宜。

2.2.3 發酵時間對總黃酮含量的影響

微生物的生長量、生長速率、代謝強度以及代謝物的量均受到發酵時間的影響[21]。在發酵初期，營養充足，菌體生長迅速，由圖4可知，發酵時間從2 h到4 h時，總黃酮含量達到峰值，為23.65 g/L，且差異顯著（P＜0.05）；延長發酵時間到6 h時，總黃酮含量顯著下降（P＜0.05），繼續延長發酵時間總黃酮含量呈下降趨勢，但無顯著差異（P＞0.05）。因此，選擇發酵時間4 h為宜。

圖4 發酵時間對總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total flavonoids content

2.2.4 發酵溫度對總黃酮含量的影響

圖5 發酵溫度對總黃酮含量影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on total flavonoids content

由圖5可知，當發酵溫度從20℃增加到30℃時，總黃酮含量增加到峰值，之后呈下降趨勢，當發酵溫度為45℃時，總黃酮含量下降極顯著（P＜0.01）。分析原因可能是溫度高使得營養物質消耗快，菌體易衰老，影響菌體生長及黃酮類物質積累[22]，總黃酮量減少；也可能是20～35℃是該菌株進行酶轉化反應的最適溫度范圍，因此，選擇發酵溫度30℃為宜。

2.3 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，固定發酵溫度為30℃，以發酵時間（X1）、接種量（X2）和初始pH（X3）為自變量，總黃酮含量（Y）為響應值，響應面Box-Behnken法優化試驗方案及結果如表3所示。采用Design Expert 8.0.5軟件對表3結果進行多元回歸擬合，模型及方差分析結果見表4，所得多元回歸方程為：

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiments

表4 響應面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface regression model

由表4方差分析可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.336 0＞0.05），表明二元回歸方程較高程度擬合試驗數據。模型信噪比為39.106＞4，變異系數（coefficient of variation，CV）為0.68%，預測擬合度0.954 1和校正擬合度0.988 7一致，表明回歸模型干擾信號少，可信度高，相關性和穩定性良好，可用于實驗預測。F值反映了各因子對響應值的重要性。根據表4中F（X1）=304.43＞F（X3）=169.91＞F（X2）=105.09可知，各因素對總黃酮含量的影響為發酵時間＞初始pH＞接種量；同時，各因子對總黃酮含量均有極顯著影響（P＜0.01），表明發酵時間、接種量、初始pH與總黃酮含量間不是簡單的線性關系，各因子間存在顯著的交互作用影響。相關系數R2=0.995 1，表明該模型能解釋99.51%的因變量變化，即只有0.49%能影響總黃酮含量的作用變量未納入該多元回歸預測模型。因此，該二元回歸擬合方程能用于4#菌株發酵轉化藜蒿水提液總黃酮工藝過程的預測。

擬合多項式模型的響應面可視化結果，其等高線和響應面形狀能直觀地反映發酵時間、接種量、初始pH及其交互作用對總黃酮含量的影響程度和模型的極值情況，結果見圖6。由圖6可知，發酵時間和接種量、發酵時間和初始pH以及接種量和初始pH的等高線中心區域均呈橢圓形，表現出明顯的交互作用；三個響應曲面均是開口朝下的凸面，說明在試驗點連續區域內存在極大值。用Design Expert 8.0.5軟件自動求解總黃酮最佳含量發酵工藝為發酵時間3.26 h、培養基∶菌懸液270∶1（V/V）、初始pH 7.4，總黃酮含量預測值為24.79 g/L。

圖6 發酵時間、接種量和初始pH交互作用對總黃酮含量影響的響應面及等高線Fig.6 Response surfaces plots and contour lines of the effects of interactions between fermentation time,inoculum and initial pH on total flavonoids content

2.4 響應面驗證試驗

為便于實際操作，將最佳發酵條件修正為：發酵時間3.5 h、培養基∶菌懸液270∶1（V/V）、初始pH 7.4，按前述操作在30℃、150 r/min條件下發酵，進行3次驗證試驗，測定樣液總黃酮含量，實測總黃酮含量為（24.72±0.41）g/L，與理論預測值偏差為0.28%，基本吻合，表明二元回歸多項式模型能用于菌株4#發酵轉化藜蒿水提液中總黃酮工藝過程的指導和預測。相比表2対照液中3.27 g/L的總黃酮含量，菌株4#發酵后藜蒿水提液中總黃酮含量大幅度提高，在最佳條件下總黃酮含量是優化前的7.56倍，表現出良好的工業應用前景。

3 結論

針對大別山黃岡地區“散花藜蒿”特色資源，本實驗從根際土壤篩選到能轉化藜蒿黃酮類物質的菌株4#，根據形態及顯微結構特征初步鑒定為芽孢桿菌屬菌株。利用單因素和響應面法確定該菌株發酵轉化藜蒿水提液中總黃酮最佳工藝為：發酵溫度30℃、發酵時間3.5 h、接種量（培養基∶菌懸液）270∶1（V/V）、初始pH 7.4，在150 r/min條件下發酵，實測總黃酮含量達到（24.72±0.41）g/L，是轉化前藜蒿水提液中總黃酮含量的7.56倍，從而為大別山富余藜蒿資源的深加工和綜合利用提供了試驗依據。

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