毒胡蘿卜素誘導內質網應激對小鼠調節性T細胞免疫功能的影響

馮珍珍，劉螢，董寧，于燕，馬濤，姚詠明

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞內的重要細胞器，參與調節蛋白質折疊、生物合成、翻譯后修飾等。在應激條件下，如鈣離子平衡紊亂、蛋白質糖基化狀態改變、突變蛋白表達等引起ER腔內未折疊或錯誤折疊蛋白聚集，導致ER內穩態失衡[1]，進而觸發內質網應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)[2]。研究表明，ERS不僅是生理狀態下維持機體穩態的重要機制，也參與糖尿病、腎臟疾病、神經退行性疾病、心血管系統疾病等病理生理過程[3-5]。近年來研究發現，ERS亦可影響巨噬細胞及樹突狀細胞(DC)等免疫細胞的功能，參與對免疫細胞功能的調節[6-8]。調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)作為一類具有顯著免疫調節效應的CD4+T細胞亞群，在維持免疫穩態、保持免疫耐受等方面發揮重要作用[9-11]。但ERS是否影響Treg介導的免疫功能，目前尚不清楚。本研究以ERS特異性誘導劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)體外刺激小鼠脾臟Treg，分析對Treg免疫反應及ERS相關信號通路的影響，探討ERS對Treg功能的調節效應及可能的信號機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑 6～8周雄性BALB/c小鼠，購自中國醫學科學院實驗動物中心。小鼠臟器淋巴細胞分離液、RPMI 1640培養液均購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司。磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京索萊寶科技有限公司。TG購自美國Sigma公司。純化抗CD3/CD28抗體、別藻藍蛋白(APC)標記的抗小鼠細胞毒性T細胞相關抗原4(CTLA-4)抗體、藻紅蛋白/青色素染料7(PE-Cy7)標記的抗小鼠叉頭翼狀螺旋轉錄因子(Foxp3)抗體均購自美國eBioscience公司。抗葡萄糖調節蛋白78(GRP78)抗體、抗真核細胞轉錄啟始因子(eIF2α)抗體及抗磷酸化eIF2α(p-eIF2α)抗體、抗轉錄激活因子(ATF)4抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。Mini MACS磁性分離儀Treg分離磁珠為德國Miltenyi Biotec公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠脾臟細胞分離與單個核細胞的制備小鼠斷頸處死后無菌留取脾臟置于平皿中，加入3～5ml PBS緩沖液，剪刀剪碎，置于200目濾網上，5ml注射器活塞輕輕研磨，PBS緩沖液沖洗平皿和濾網，收集細胞濾液于15ml離心管中。1500r/min離心5min后棄上清，適量PBS緩沖液重懸細胞制成細胞懸液，緩慢加入到2倍體積的小鼠淋巴細胞分離液中，3000r/min離心15min后吸取中間層絮狀物于15ml離心管中。適量PBS緩沖液離心洗滌2次，所得細胞即為小鼠脾臟單個核細胞。

1.2.2 Treg的分離與鑒定 采用Mini MACS免疫磁性分離系統分離Treg：①每1×107細胞加入30μl PBS和10μl生物素偶聯抗體雞尾酒液，4℃避光孵育10min；每1×107細胞加入20μl抗生物素磁珠及10μl PE標記的抗CD25 抗體，4℃避光孵育15min；收集LD柱陰性分選后留出的細胞懸液，離心棄上清獲取CD4+T淋巴細胞。②每1×107細胞加入90μl PBS和10μl抗PE磁珠，4℃孵育15min；加入到MS柱中進行第2次分選，收集留出的細胞懸液為T淋巴細胞，陽性分選得Treg，細胞計數。取1×105細胞置于流式上樣管中，定容至100μl，加入抗CD4–FITC抗體(0.25μg/106)，避光孵育15min，定容至200μl，上流式細胞儀檢測雙陽性細胞的純度。

1.2.3 細胞培養與TG刺激 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基重懸Treg細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，加入抗CD3/CD28(抗CD3抗體2μg/ml，抗CD28抗體1μg/ml)抗體，接種于96孔板中，每孔200μl。TG刺激設0.05、0.1、0.2μmol/L(n=4)3個濃度，以0μmol/L為對照；設6、12、24h(n=4)3個刺激時間，以刺激0h為對照。

1.2.4 流式細胞術檢測Treg Foxp3及CTLA-4的表達

收集細胞，PBS洗滌細胞2次，100μl PBS重懸細胞，加入APC標記的抗小鼠CTLA-4抗體。4℃避光孵育30min，2ml破膜緩沖液洗滌2次，加入1ml破膜液，4℃避光過夜。離心棄上清，細胞重懸于100μl破膜緩沖液中，加入PE-Cy7標記的抗小鼠Foxp3抗體，4℃避光45min，2ml破膜緩沖液洗滌2次，重懸細胞于破膜緩沖液中，流式細胞儀檢測Treg Foxp3及CTLA-4的表達水平。

1.2.5 Western blotting檢測Treg中ERS信號通路相關分子的表達 Treg按每孔2×106個接種于6孔板中，每孔加入CD3/CD28刺激活化，實驗組加入TG，使TG在細胞懸液中的濃度為0.1μmol/L，培養12h后收取細胞，提取蛋白，采用BCA法對總蛋白定量分析。各組細胞蛋白上樣量為30μg，SDS-PAGE電泳，電泳完成后進行電轉膜。一抗、二抗孵育醋酸纖維素膜，二抗為辣根過氧化物酶標羊抗兔IgG單克隆抗體(1:5000)，洗膜后進行發光顯影。

1.2.6 流式細胞術檢測效應T細胞(Teff)增殖活性在1ml Teff懸液中加入1μl CellTraceTM試劑室溫避光孵育20min；加入5倍體積的含10%胎牛血清的培養基，37°孵育5min終止反應。離心棄上清，PBS細胞重懸Teff，3×104個Teff與各組Treg 1:1共培養72h，收集細胞，流式細胞儀檢測Teff增殖情況。

1.2.7 ELISA檢測細胞因子分泌水平 收集Treg單獨培養或與Teff共培養上清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測Treg單獨培養上清中白介素(IL)-10、轉化生長因子(TGF)-β及共培養上清中IL-4、干擾素(IFN)-γ、IL-2生成水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠Treg分離純度 小鼠單個核細胞經過兩次MACS分選后，得到Teff的純度為88.2%，Treg純度為91.0%(圖1)，臺盼藍染色檢測細胞活性為97.0%。

2.2 TG刺激對Treg Foxp3及CTLA-4表達的時效-量效關系 與對照及刺激6h相比，TG(0.1μmol/L)作用12、24h均可誘導Treg Foxp3表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。但刺激12h與刺激24h兩組間比較，Foxp3的表達差異無統計學意義(P＞0.05)。CTLA-4的表達在刺激各時間點的變化差異均無統計學意義(P＞0.05，圖2A)，與對照及0.05μmol/L濃度相比，TG濃度為0.1、0.2μmol/L時Foxp3的表達明顯增強(P＜0.05)，但兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。CTLA-4的表達在各劑量組亦未見明顯變化(P＞0.05，圖2B)。依據Foxp3表達變化情況，選定TG 0.1μmol/L和12h為后續實驗的刺激濃度和時間。

圖1 磁珠分選Treg純度Fig.1 Treg purity sorted by magnetic beads

圖2 TG刺激后Treg Foxp3及CTLA-4的表達Fig.2 Expressions of Foxp3 and CTLA-4 on Tregs after TG stimulation

2.3 Western blotting檢測TG刺激誘導的Treg ERS反應 與對照組相比，0.1μmol/L TG刺激12h可誘導Treg中ERS信號通路蛋白GRP78、ATF4表達水平顯著上調，ERS信號通路關鍵性調節分子eIF2α磷酸化水平明顯增加，p-eIF2α/eIF2α比值增加，差異均具有統計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 TG刺激誘導Treg中ERS信號通路相關分子表達Fig. 3 Effect of TG on the expression of ERS signaling pathway-related molecules in Tregs (Western blotting)(1)P＜0.05 compared with control group

2.4 TG刺激對Treg細胞因子IL-10和TGF-β生成的影響 與對照組相比，TG刺激后Treg培養上清中IL-10及TGF-β的生成明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05，圖4)。

2.5 TG刺激Treg對Teff增殖及Th1/Th2分化的影響與對照組相比，TG刺激組Treg可明顯抑制Teff增殖活性，差異有統計學意義(P＜0.05，圖5A)。與對照組相比，TG刺激組共培養上清中IL-4/IFN-γ比值明顯升高，IL-2分泌水平明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05，圖5B)。

圖5 TG刺激Treg對Teff增殖活性及共培養上清中細胞因子分泌情況的影響Fig.5 Effect of TG-stimulated Tregs on proliferative activity of Teff and secretion of cytokines in co-cultured supernatants

圖4 TG刺激Treg培養上清中IL-10及TGF-β的生成情況Fig.4 Effect of TG on the production of IL-10 and TGF-β in Treg culture supernatants

3 討 論

Treg細胞是一類具有特殊免疫學效應的CD4+T淋巴細胞亞群，主要介導免疫抑制效應，通過實現對天然和特異免疫反應的負性調節，在保持自身免疫耐受、免疫穩態調節等方面發揮重要作用。Treg數量和(或)功能的變化也被證實是移植耐受、過敏反應、自身免疫病、感染免疫等疾病的重要病理生理基礎[9]。因此，研究Treg功能變化的機制對于免疫相關疾病的干預和治療具有重要意義。

ERS是ER在應對多種生理或病理條件下引起的ER腔內未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白聚集的應激性反應。GRP78是ERS反應的標志性蛋白，應激狀態下，GRP78作為伴侶分子與ER上的跨膜蛋白解離，與腔內未折疊或錯誤折疊蛋白結合，促進異常蛋白質的修飾、折疊和轉運；GRP78表達的增加提示ERS反應的發生[12]，eIF2α和ATF4是ERS誘導PERK信號通路中的重要組分，eIF2α的磷酸化將減緩蛋白質的合成，減輕ER蛋白合成負荷，同時上調下游轉錄因子ATF4的表達，進一步抑制ER內蛋白質的合成[13]。本研究使用ERS特異性誘導劑TG刺激Treg后，可以檢測到Treg中GRP78表達增強，磷酸化eIF2α表達增加，ATF4表達亦明顯上調，提示TG刺激后Treg發生明顯ERS反應，以利于恢復或保持Treg內ER穩態。

近年來研究提示，ERS對免疫細胞的功能及活性有重要的調節作用。我們的既往研究顯示，HMGB1刺激可激活DC中ERS反應，引起DC表面標記分子表達上調，誘導炎性細胞因子生成增加[8]；Solanki等[6]發現ERS相關信號通路的活化可明顯增強巨噬細胞的抗凋亡能力，加重動脈粥樣硬化斑塊病灶的進展。本組資料中，我們采用TG刺激，不僅可以觀察到Treg中ERS反應的活化，Treg介導的免疫功能也發生明顯改變。Foxp3是Treg最具特異性的分子標志物，其表達水平高低是決定Treg功能活性的關鍵因素[14-15]。本研究結果顯示，TG刺激可明顯誘導Treg中Foxp3表達，且在0.1μmol/L TG刺激12h時表達明顯。進一步分析發現，TG刺激后Treg對Teff的增殖抑制作用明顯增強，并且共培養上清中細胞因子IL-4/IFN-γ比值明顯增加，IL-2的分泌水平降低，Th1/Th2平衡向Th2方向分化。以上結果顯示，TG在誘導Treg發生 ERS反應的同時，對Treg免疫功能也有確切的活化調節效應。

目前已明確，Treg主要依靠細胞接觸依賴和非接觸依賴機制發揮免疫抑制效應[16]。CTLA-4組成性表達于Treg，可與Teff表面相應受體結合，激活Teff內相應信號通路，進而抑制Teff的增殖活性及IL-2等細胞因子的表達，是Treg發揮細胞接觸依賴抑制效應的重要分子[17]。但本研究結果顯示，不同濃度TG(0、0.05、0.1、0.2μmol/L)刺激不同時間(0、6、12、24h)，Treg上CTLA-4的表達與對照組相比均無明顯變化，提示ERS增強Treg活性并非通過CTLA-4介導的細胞接觸依賴機制發揮作用，但本研究尚不能排除膜型TGF-β、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體等的作用。IL-10及TGF-β是Treg發揮負性免疫調節效應的重要細胞因子，可直接作用于免疫細胞，發揮負性調節效應[18]。本研究中，我們發現TG刺激后Treg培養上清中IL-10及TGF-β的生成明顯增加，提示TG誘導的ERS反應可能通過增強Treg細胞因子的生成能力，以非接觸依賴機制發揮免疫抑制效應，但具體作用機制尚待進一步澄清。

研究證實，ERS作為細胞應對應激狀態的一種自我保護機制，通過抑制早期蛋白質的合成、增加內質網分子伴侶的表達、加速未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白的降解促進ER穩態的恢復。本研究結果顯示，ERS不僅是作為細胞的穩態調節機制，而且在受到TG刺激后，Treg通過活化ERS相關信號通路，恢復Treg中ER穩態的同時，對Treg的免疫反應也具有明確的調節效應。鑒于ERS參與包括神經退行性疾病、心血管疾病、膿毒癥等病理生理過程[3-4,19]，闡釋ERS與Treg的關系及其調控機制，可能為進一步探討Treg介導免疫性疾病的干預及治療提供潛在靶點。

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