一種具有磷酸酶活性的金黃色葡萄球菌蛋白的初步鑒定

于立權 呂茂麗 吳志軍 劉振華 李玉環 崔玉東

摘 要：金黃色葡萄球菌是一種人畜重要的致病微生物，尋找新型藥物靶標是及時有效治療金黃色葡萄球菌感染的潛在途徑。本實驗依據數據庫，體外設計并合成了一對特異引物，應用PCR方法擴增出一種新的磷酸酶基因，并將該基因克隆至表達載體pET2a上。經測序、酶切和PCR鑒定正確后轉化大腸桿菌感受態細胞BL21中，經IPTG體外誘導表達出重組蛋白并對其進行了磷酸酶活性測定。結果表明：該基因編碼蛋白具有更多依賴于鎂離子的磷酸酶活性，這種酶活性受到特異性抑制劑氟化鈉的抑制。研究結果為進一步挖掘該蛋白作為金黃色葡萄球菌感染有效治療藥物靶點提供了數據資料。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；磷酸酶；酶活性

中圖分類號 R378 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）07-0028-3

Elementary Identification of Activity of Phosphatase of Protein from Staphylococcus aureus

Yu Liquan et al.

（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：Staphylococcus aureus is an important pathogenic microorganism，and the exploration of novel drug targets is a potential way to effective timely conduct the infection of Staphylococcus aureus. Based on the database，a pair of special primers were designed and synthesized in vitro. A new phosphatase gene was amplified by PCR，and the target gene was cloned to the vector pET2a. After sequencing，enzyme digestion and PCR identification，the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21. The recombinant protein was induced by IPTG in vitro and the activity of enzyme was determined. The results showed that the protein coded by the target gene had activity of phosphatase which was more dependent on magnesium ion. The activity of protein enzyme was specific inhibited by sodium fluoride. The results provide data for the further excavation of this protein as an effective therapeutic drug target for Staphylococcus aureus infection.

Key words：Staphylococcus aureus；Phosphatase；Enzyme activity

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人畜重要的致病微生物，能引起廣泛的人畜局部或全身感染而導致疾病發生[1，2]，如畜牧業上奶牛乳房炎和子宮內膜炎[3]、醫院或社區內肺炎[4]、敗血癥和膿毒癥[5]等感染性疾病。隨著大量頭孢菌素尤其是第三代頭孢菌素等高效廣譜抗菌藥物的大量使用和濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株頻現，多重耐藥性增加，給人類公共衛生安全造成了極大的威脅[6]。因此，迫切需要尋找一種替代預防或治療金黃色葡萄球菌感染的新型藥物。

金黃色葡萄球菌含有很多致病因子，如溶血素、殺白細胞素、腸毒素等毒素[7]和凝固酶、耐熱核酸酶、酚可溶性調節蛋白（PSM）等侵襲性酶類[8]。目前，雖然國內外對于金黃色葡萄球菌這些致病因子的分子特征、作用機制、臨床應用潛能等方面研究較多[9-11]，但對于具有免疫抑制性和耐藥性的金黃色葡萄球菌研究遠遠不夠，需要進一步深入挖掘。

由磷酸激酶和磷酸酶控制的底物可逆磷酸化是細胞應對外界刺激的一個關鍵調控機制，可以使靶蛋白在活化與失活之間轉換，從而實現胞內信號傳導途徑的激活或失活，進而調控著細胞的生長、增殖和脅迫響應[12]。越來越多的研究表明，磷酸酶在金黃色葡萄球菌中調控著壓力脅迫感應和生物膜形成等許多細胞過程，并與毒力密切相關[13-15]。為深入探索磷酸酶在金黃色葡萄球菌可逆磷酸化信號通路中的功能和識別新藥靶標，本實驗體外克隆表達了一種具有磷酸酶活性的金黃色葡萄球菌蛋白并進行了活性測定，研究結果可為將來新型抗菌藥物開發提供更多的科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 實驗中所用的金黃色葡萄球菌菌株Newman、大腸桿菌DH5α和BL21、質粒pET32a為本實驗室保存。

1.2 工具酶和生化試劑等 限制性內切酶購自Thermo scientific公司，Taq DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司，PMD18-T和T4 DNA連接酶購自大連寶生物公司。基因組提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒及膠回收試劑盒購自Axygen公司，蛋白磷酸酶測定試劑盒購自Promega公司。

1.3 引物設計 根據Pubmed數據庫中一個假定的金黃色葡萄球菌磷酸酶的基因序列，利用Primer5軟件設計相應的引物F1和R1，上游引物F1引入BamH I位點，下游引物R1引入Sal I位點。引物委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列如下：

F1：5'-GCCGGATCCAAGATAGGGACAATCGCCG-3'，

R1：5'-GCGGTCGACAATTTCTATTATTTGTATCGTC

TC-3'。

1.4 磷酸酶基因的克隆和驗證 以基因組試劑盒提取的金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，用引物F1和R1進行PCR擴增。反應條件為：95℃預變性5min，然后95℃ 30s，60.3℃ 30s，72℃ 1min，共30個循環，末次循環后72℃延伸5min。PCR反應結束后，產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。將用PMD18-T載體進行TA克隆的重組質粒進行測序。將測序正確的重組質粒和載體pET32a分別進行BamH I/Sal I雙酶切，回收純化后進行連接轉化大腸桿菌。用酶切和PCR方法驗證陽性克隆。

1.5 磷酸酶基因的原核表達 以1：100稀釋過夜培養的重組菌，接種于含有100μg/ml氨芐的LB液體培養基中培養。當菌液OD600達到0.5時，加入終濃度為1mM的IPTG進行誘導。將菌體離心收集后超聲裂解，SDS-PAGE電泳分析。在進行酶活性測定時，大量表達的蛋白是以包涵體形式存在的。實驗中用含8M尿素的緩沖液溶解包涵體，再緩慢稀釋至溶液中尿素終濃度為2M。

1.6 酶活性測定 按照磷酸酶測定試劑盒的說明書進行。實驗中分別設置組別為：酶、底物、酶+底物、酶+底物+氯化鎂、酶+底物+氯化鎂+氟化鈉、酶+底物+氯化錳、酶+底物+氯化錳+氟化鈉。每組樣品加入緩沖液后37℃反應3min，隨后加入終止液室溫作用15min。酶標儀測定OD600nm值，根據標準曲線換算成磷酸根濃度。實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 磷酸酶基因的PCR擴增與重組質粒的酶切鑒定 以金黃色葡萄球菌Newman基因組為模板，PCR擴增得到約800bp的目的條帶（圖1）。將TA克隆的重組質粒進行測序后，顯示序列全長為804bp，其核苷酸序列與NCBI數據庫上相對應的核苷酸序列同源性達100%。將用pET32a載體亞克隆得到的質粒轉化大腸桿菌BL21，小量培養后提取質粒，BamH I/Sal I雙酶切后獲得約0.8kb和約5.9kb大小兩條條帶，與預期結果一致（圖2），說明重組表達質粒構建成功。

2.2 磷酸酶的大腸桿菌異源表達 將構建好的重組表達質粒轉化BL21菌株，以1M濃度的IPTG進行誘導表達。同時設未轉入空載體空菌和轉入空載體的BL21做對照。結果顯示，通過設定的不同誘導時間誘導，重組蛋白均有很好表達，且隨著時間的延長，重組蛋白表達量并沒有發生顯著變化。在空菌和含有表達載體pET32a的菌體中，均可見在約在34kDa左右有菌體本身的一種蛋白存在。我們表達的目標蛋白的電泳行為正好與該蛋白的電泳行為相似（圖3）。可以判斷，在IPTG誘導的重組菌體中，實際重組蛋白是誘導表達的，這在后續的酶活性測定中可以間接說明這一點。

2.3 磷酸酶的酶活性體外測定 大量表達的包涵體蛋白用尿素溶解稀釋后，應用商品化試劑盒，對合適濃度的蛋白進行了酶活性測定。當僅僅加入酶或和底物時，反應體系中游離磷酸的含量很低。但加入Mg2+后，酶與底物寡肽反應釋放的游離磷酸量增高，達到0.34%，加入磷酸酶特異性抑制劑NaF后，反應體系中的酶活性受到抑制，降到僅僅加入酶或和底物時的水平。加入Mn2+后，酶與底物寡肽反應釋放的游離磷酸量增高，達到0.36%，增高的量略大于加入Mg2+增高的量的水平，加入磷酸酶特異性抑制劑NaF后，反應體系中的酶活性受到稍微抑制，說明該蛋白的酶活性主要依賴于Mg2+（圖4）。

3 結論與討論

因金黃色葡萄球菌感染導致的疾病類型多樣，病情復雜。同時，由于當今臨床上激素、抗生素等的過度應用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株特別是多重耐藥菌株的頻現，迫切需要新型的金黃色葡萄球菌感染預防治療藥物和全新的治療方案[16，17]。

雖然對于金黃色葡萄球菌的致病機理等研究較多[8，10]，但對于關乎金黃色葡萄球菌致病力的磷酸化信號轉導通路的研究依然很少[13，15]，需要深入挖掘磷酸化相關節點蛋白[18]，進而研究這些蛋白在金黃色葡萄球菌致病力中的貢獻，來發現和識別新型藥物靶標。

本研究對Pubmed數據庫中一種生物信息學分析具有磷酸酶活性的金黃色葡萄球菌蛋白進行了體外克隆表達并進行了酶活性分析，初步鑒定為一種更多依賴Mg2+活性的磷酸酶，這種酶活性受到特異性抑制劑NaF的抑制。研究結果為將來開展一系列針對金黃色葡萄球菌磷酸酶為藥物靶點的篩選工作奠定了基礎。

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（責編：施婷婷）