重慶地區22個STR基因座突變分析

張丹妍，楊玉有，楊智曦，李新生，呂 靜，馬明福，李練兵

（重慶市人口和計劃生育科學技術研究院/國家衛生計生委出生缺陷與生殖健康重點實驗室/重慶市正鼎司法鑒定所，重慶 400020）

短串聯重復序列（short tandem repeats，STR）普遍存在于人類基因組中，是具有多態性的一類DNA序列。STR通常由2～6 bp核心序列串聯重復而成，重復次數從幾次到幾十次不等[1-2]。STR具有種類多、分布廣、多態性高、擴增成功率高、檢測靈敏、重復性好、高雜合度、容易檢測并遵循孟德爾共顯性遺傳規律等特點，在法醫學親子鑒定、個體識別及遺傳病連鎖分析等方面應用廣泛[3-5]。但是法醫學檢案過程中，STR基因座的突變現象不少見，會一定程度上影響案件結論，因此，法醫學實踐中學者們對突變現象日益關注。在美國人群中，父源基因突變率在0.007%～0.371%之間（來自美國血庫協會研究報道）[6]；而STR基因突變率國內學者研究報道在0.004%～0.404%之間[7-10]。本研究選擇了2016年度重慶地區人群的1596例支持存在親權關系的案件為觀察研究對象，分析案件中22個常染色體STR基因座突變情況及特點，以期儲備重慶地區STR 基因突變的基礎遺傳學信息。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1596例親子鑒定案例均來自重慶市正鼎司法鑒定所的日常檢測案例，三聯體（父親—孩子—母親）親子鑒定案件563例，二聯體（父親—孩子或母親—孩子）1033例，鑒定結論均為支持存在親權關系。家系案例樣本大部分為血液或血斑，小部分為唾液斑、帶毛囊毛發。

1.2 儀器和試劑

VeritiTM96-Well Thermal Cycler PCR 擴增儀（ 美國AB公司）；3130型或3500型DNA遺傳分析儀（美國AB公司）；AGCU Expressmarker22 熒光檢測試劑盒（簡稱AGCU Ex22 kit）和AGCU 21+1 STR熒光檢測試劑盒（簡稱AGCU 21+1 kit）（中國無錫中德美聯公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

樣本的基因組DNA采用Chelex-100法提取。

1.3.2 PCR擴增

采用AGCU Ex22 kit對22個STR基因座（D3S1358、D13S317、D7S820、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、D16S539、Penta E、CSF1PO、Penta D、D10S1248、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391和FGA）及1個性別基因座Amelogenin進行聚合酶鏈反應（PCR）復合擴增。PCR擴增體系為10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、EX22 Primers 2.0 μL、熱啟動C-Taq酶0.4 μL、DNA模板1.0 μL（DNA濃度為0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.6 μL。PCR循環條件為初始變性95℃ 2 min，熱循環（10個循環：94℃ 2 min，60℃ 1 min，72℃1 min；20個循環：90℃2 min，58℃1 min，72℃1 min），終延伸72℃ 10 min，保溫4℃維持。每個擴增體系中設立陽性對照DNA為女性細胞株9947A和陰性對照（空白DNA用去離子水替代）。若出現1-2個不符合遺傳規律的STR基因座，加測AGCU 21+1 kit。AGCU 21+1 Kit含22個STR基因座（D10S1248、D6S474、D12ATA63、D2S441、D22S1045、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D19S433、D6S1017、D4S2408、D17S1301、D2S1776、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D10S1435和D5S2500）及1個性別基因座Amelogenin，其中D10S1248、D2S441和D19S433這3個STR基因座為AGCU EX22 kit和AGCU 21+1 kit共有，可以進行復核比對。AGCU 21+1 kit的PCR擴增體系為10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、Primers 21+1 2.0 μL、熱啟動C-Taq酶0.3 μL、DNA模板1.0 μL（DNA濃度為0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.7 μL。每個擴增體系中設立陽性對照DNA為女性細胞株9947A和陰性對照（空白DNA用去離子水替代）。PCR循環條件為初始變性95℃ 2 min，熱循環（30個循環：94℃ 30sec，60℃ 1 min，65℃ 1.5 min），終延伸60℃1 hour，保溫4℃維持。

1.3.2 STR基因座檢測

使用3130或3500遺傳分析儀對擴增產物進行毛細管電泳，用Gene Mapper ID v3.2或Gene Mapper?ID-X軟件對STR基因座進行分析。分型標準含分子量內標和等位基因分型標準物。

1.3.3 STR突變基因的確定

如果所有檢測的22個STR基因座均符合孟德爾遺傳規律，并且累計親權指數（CPI）大于10000，則支持存在親權關系。如果有1或2個STR基因座結果違反遺傳規律或CPI在0.0001至10000之間，本研究增加AGCU 21+1 kit檢測。參照司法部《親權鑒定技術規范》（SF/ZJD0105001-2016）計算突變基因座的PI。如果增加檢測試劑盒沒有發現新的違反遺傳規律基因座并且計算CPI大于10000，那么支持存在親權關系。該違反遺傳規律的基因座認為是突變基因座。如果CPI小于0.0001，認為排除存在親權關系[11]。

1.3.4 STR基因座突變分析方法

突變步數即為重復單位的增加（+n）或者減少（-n）。在父母的等位基因中，突變基因以重復單位相差最小的親代等位基因為準。如果步數相差相同，突變基因參考結構相似的等位基因。如果步數相同、結構相似即增加或者減少步數相同則判斷為不能確定[9]。對突變基因座的數量、突變來源、突變步數及重復單位的增加或減少進行統計，通過直接計數法和EXCEL軟件計算突變基因座的突變率。另外，分析突變來源、突變步數在整體突變事件中所占比例。突變相關因素之間的關系利用SPSS 15.0軟件進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 STR基因突變座分析

1596例支持存在親權關系的親子鑒定案例中，二聯體案件有1033例，三聯體案件有563例，共觀察到2159次減數分裂。研究中觀察到52例突變（二聯體案件有22例，三聯體案件有30例），其中51例是父親或母親一方有1個基因座發生突變（98.11%），1例為父親和母親各有1個基因座發生突變（1.89%）。22個被檢測的STR基因座中有20個座觀察到突變，FGA基因座的突變率最高，為9次（0.42%），其次D12S391基因座為6次（0.28%），Penta E基因座為5次（0.23%），D8S1179和vWA基因座為4次（0.19%），D13S317、TH01和D2S1338基因座為3次（0.14%），D16S539、CSF1PO、Penta D、D10S1248和D6S1043基因座為2次（0.09%），D3S1358、D7S820、D21S11、D18S51、D5S818為1次（0.05%）。此外，D2S441和TPOX基因座未觀察到突變（表1）。

STR基因座 突變例數 突變率（%） 一步突變 兩步突變（-2） 三步突變（+3）+1 -1 +1或-1 +3 -3 D3S1358 1 0.05（1/2159） 1 D13S317 3 0.14（3/2159） 1 1 1 D7S820 1 0.05（1/2159） 1 D16S539 2 0.09（2/2159） 2 Penta E 5 0.23（5/2159） 2 1 2 TH01 3 0.14（3/2159） 1 1 1 D2S1338 3 0.14（3/2159） 1 1 1 CSF1PO 2 0.09（2/2159） 1 1 Penta D 2 0.09（2/2159） 1 1 D10S1248 2 0.09（2/2159） 2 D19S433 1 0.05（1/2159） 1 vWA 4 0.19（4/2159） 1 1 2 D21S11 1 0.05（1/2159） 1 D18S51 1 0.05（1/2159） 1 D6S1043 2 0.09（2/2159） 2 D8S1179 4 0.19（4/2159） 2 2 D5S818 1 0.05（1/2159） 1 D12S391 6 0.28（6/2159） 2 2 1 1 FGA 9 0.42（9/2159） 3 3 3合計 53 2.45（53/2159） 22 14 13 1 2 1

2.2 突變步數

STR基因座突變步數在52例突變案例中，共觀察到53次突變，其中一步突變49次（92.45%），二步突變1次（1.89%），三步突變3次（5.66%）。一步突變現象里減少1個重復單位（-1）有12次，增加1個重復單位（+1）有22次，不確定是增加或者減少1個重復單位的13次；兩步突變現象為減少2個（-2）重復單位；三步突變分別為2個（+3）和1個（-3）重復單位。突變等位基因的步數比較，差異有統計學意義（x2=126.423，P＜0.001）。

2.3 突變來源

在觀察到的53次突變中，50次來源于父系，占94.34%，3次來源于母系，占5.66%，不能確定無。父系來源突變與母系來源突變的比例約16.67:1，差異有統計學意義（x2=83.358，P＜0.001）。

3 討 論

3.1 STR基因座的突變率分析

研究STR基因座的突變率應該至少要觀察500次細胞減數分裂[12]。本文采用AGCU EX22 kit檢測并統計了1596例支持存在親權關系的案例。研究結果發現共有2159次減數分裂，其中有20個基因座存在基因突變現象，突變率在0.05%～0.42%之間，略高于美國血庫協會2008年公布的年度數據。針對基因座的結構和重復序列中核心序列的重復次數分析，發現突變率可能與基因座的多態性及片段長度有關。如核心序列重復次數大于10次的FGA、Penta E、vWA、D8S1179基因座突變率較高。通常應用于親權鑒定的遺傳標記STR的總突變率應不高于0.2%。本研究中FGA、Penta E、D12S391基因座的總突變率大于0.2%，因此在法醫物證檢案中應注意突變問題，必要時采取其他手段輔助鑒定以降低誤判風險。此外，本次研究顯示三聯體的突變率是5.33%（30/563），二聯體的突變率是2.13%（22/1033），三聯體的突變率明顯高于二聯體，發生此情況的原因可能是二聯體少了父親或母親一方的遺傳信息，部分突變案例沒能被發現。

3.2 STR基因座的突變機制及模式分析

STR基因座突變機制認為主要由于復制滑動或復制滑鏈錯配引起。常用的STR基因座突變率在0.1%～0.5%。STR基因座的突變表現為重復單位數目的改變，主要分為兩類：一步突變和多步突變[13-14]。串聯排列的正向重復序列以及重復次數較多的序列中發生復制滑鏈錯配的概率較大，突變率也相應較大。步數越少，發生突變的概率相對較大。另外一步突變可通過累積發生多步突變。STR基因座主要是以逐步突變模式發生，以單個重復單位的增減為主，占90%以上，兩個或者更多重復單位改變較少見。本研究結果顯示一步突變率為92.45%，明顯高于二步和三步突變，與先前所報道的結果一致[15]。

3.3 STR基因座突變與性別、年齡

據李秋陽等報道，性別差異在突變現象中較明顯，男性于女性發生突變的比例為8:1，此外突變與父親年齡相關，突變率隨父親的年齡的增加也有增加趨勢[16]。本研究顯示父系與母系來源的突變存在顯著的性別差異（比例為16.67:1），這和李秋陽等報道的結果一致。發生顯著差異的原因可能是在男性精母細胞逐步分裂成精子的過程中，細胞需要的分裂次數比女性配子細胞成熟需要分裂的次數要多得多，所以產生突變的概率變大。本文觀察到50例STR基因座突變來源于父親，他們生育小孩的年齡最小25歲，最大54歲。

3.4 STR基因座突變的應對

在親權鑒定案件中，按照司法部《親權鑒定技術規范》（SF/ZJD0105001-2016）要求，鑒定中遺傳標記累計非父排除率均應不小于0.9999，計算CPI＞10000視為支持存在親權關系；CPI＜0.0001，則排除存在親權關系。如果0.0001＜CPI＜10000，應通過增加檢測的遺傳標記來達到要求。本文用AGCU EX22 kit常規檢測22個STR基因座，若所測基因座符合遺傳規律，CPI＞10000，則支持存在親權關系（1596例）。由于STR基因座在遺傳過程中會產生突變，本研究在出現1～2個STR基因座不符合遺傳規律加測了AGCU 21+1 kit。如果增測后沒有發現不符合遺傳規律的基因座，計算CPI 大于 10000，我們認為該STR基因座發生了突變（52例）。如果涉及的STR基因座突變案件中該STR基因座檢測結果為純合子時，我們會用IdentitiflerTM試劑盒對該樣本重新檢測，防止發生等位基因丟失（Null allele）而導致假突變現象。本研究中發現的52個突變案件，均檢測了40個STR基因座，其中發現的STR基因座不符合孟德爾遺傳規律均可能是在遺傳過程中STR基因座發生突變所引起。我們后續將通過測序證實突變的來源，進一步對突變家系進行研究。