pH值對白斑狗魚蛋白酶活性的影響

王擁軍，張家松，毛瑞鑫

（吉林省水產科學研究院，吉林　長春　130033）

白斑狗魚（Esox lucius）屬鮭形目（Salmoniformes），狗魚亞目（Esocoidei），狗魚科（Esocidae），狗魚屬（Esox）。主要分布于歐洲、亞洲和北美洲，在我國僅分布于新疆阿勒泰地區的額爾齊斯河流域以及附屬水體[1]，以銀鯽、貝加爾雅羅魚、尖鰭鮈等中小型魚類為食，是典型的兇猛性肉食性土著魚類[2]。

我國目前對于白斑狗魚的研究主要集中在人工養殖方面[3-5]。但關于白斑狗魚越冬期pH值對蛋白酶活性影響的研究與報道少之又少。消化酶活性與環境因素有密切關系，其中pH值是主要影響因素，通過對白斑狗魚蛋白酶進行的系列研究,期望在白斑狗魚越冬過程中對餌料選擇、配合餌料的研制等方面有所幫助,提高白斑狗魚越冬成活率和增重率。該文報道pH影響白斑狗魚蛋白酶活性的初步研究結果,供有關方面參考。

1　材料與方法

1.1　白斑狗魚來源

引自新疆、養殖地在長春養殖越冬后的白斑狗魚，取4條魚體健康體型勻稱，平均體質量為304.9 g，體長平均為38.1 cm。

1.2　試驗試劑

標準蛋白酶溶液、0.9%NaCl溶液、考馬斯亮藍染液、新鮮牛奶、95%乙醇、酚酞試劑、0.01 mol/L的NaOH溶液、1%淀粉溶液、0.025 mol/L磷酸緩沖液、pH為6.9的磷酸緩沖液、3,5-二硝基水楊酸顯色液、6 mol/L NaOH、蒸餾水、10 g/L酪蛋白、0.025 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）、10%的三氯醋酸、0.55 mol/LNa2CO3、Folin-酚試劑、0.2 mol/L 磷酸二氫鈉-檸檬酸鈉緩沖液。

1.3　試驗器材

分光光度計、試管、試管架、三角燒瓶、玻璃棒、水浴鍋、研缽、磁力攪拌器、吸量管、移液管、比色杯、剪刀、直尺、電子天平、藥勺、燒杯、漏斗。

1.4　酶粗液的制備

將白斑狗魚先在冰箱中冷凍保存，取魚4尾隨機分成兩組，每次取一組進行試驗，重復兩次，參照劉玉梅等[6]的方法制備粗提取液，測定蛋白酶的活性。在冰盤上解凍并解剖白斑狗魚，剪取從口至肛門的消化道，剔除外壁脂肪后，稱重。將所取樣品加10倍體積預冷蒸溜水，在0～4℃下研磨成勻漿，取部分勻漿直接用于測定脂肪酶的活性，反應溫度37℃。其余部分放在4℃冰箱中靜置抽提20～28 h，以便充分提取蛋白酶，然后高速冷凍離心（0～4℃，10 000 r/min）30 min，取上清液，即為酶粗提液。

1.5　酶液中粗蛋白含量的測定

粗蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法進行測定[7]。

1.6　蛋白酶活性的測定

蛋白酶活性的測定參照Folin-酚法[8]。取10 g/L酪蛋白1 mL和0.025 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）5 mL于試管中，37℃下保溫10 min，迅速加入1 mL酶液，再繼續保溫15 min，加入3 mL 10%的三氯醋酸終止反應，過濾或離心，取上清液1 mL，加入5 mL 0.55 mol/L Na2CO3和 1 mL Folin試劑，37℃水浴中顯色15 min，于波長680 nm條件下，在1 cm比色管中進行比色測定。對照管先加入終止液后加酶液。酶活性定義為每分鐘產生1 g酪氨酸為1個蛋白酶活性單位。

1.7　磷酸緩沖溶液及pH值梯度的設定

以0．2 mol/L磷酸二氫鈉－檸檬酸鈉緩沖液調節pH值，在37℃恒溫水浴鍋條件下。pH值梯度因部位不同而有區別，胃的pH梯度設定為2．0～6．5范圍內,以pH值0．5為一個梯度，肝胰臟pH值梯度設定為 3．0～7．5 范圍內,以 pH 值 0．5 為一個梯度，腸 pH 梯度設定為 5．0～9．5 范圍內，以 pH 值 0．5 為一個梯度測出各部位蛋白酶在37℃下最適宜的pH值。

1．8　數據處理

該研究用Excel對結果進行處理，并用SPSS統計軟件進行分析，P＞0．05即認為差異具統計學意義。

2　結果與分析

2．1　pH值對蛋白酶活性的影響

在 37℃下，胃蛋白酶在 pH 值 2．0～3．5 之間活性迅速上升，在pH 3．5時活性達到最高為26．056 U,此后，隨pH值增加，活性快速降低，胃蛋白酶的最適宜 pH 值為 3．5；肝胰臟蛋白酶在 pH 值 2．0～3．0之間活性迅速上升，在pH值3．0時活性達到最高為13．923 U，此后，隨pH值增加活性開始降低，在3．0～4．5 之間迅速降低，4．5 后緩慢降低，肝胰臟的最適 pH 為 3．0，前腸蛋白酶在 pH 值 8．0～9．0 之間活性成上升趨勢，在 8．0～8．5 之間上升緩慢，在 8．5 之后上升幅度迅速加大，在pH 9．0時活性達到最高為為6．89 U，此后，隨pH值增加活性迅速降低，前腸最適 pH 值為 9．0，中腸蛋白酶在 pH 值 7．5～8．5 之間活性迅速上升，在pH值8．5時活性達到最高為7．856 U；此后，隨pH值增加活性快速降低中腸最適pH值為8．5，詳見圖1和圖2，胃和肝胰臟蛋白酶的最適宜pH值在酸性范圍，前腸和中腸蛋白酶的最適宜pH值在堿性范圍內。

2．2　蛋白酶的活性比較

白斑狗魚不同器官蛋白酶活性在最適宜pH值條件下，蛋白酶的活性：胃＞肝胰臟＞中腸＞前腸（P＜0．05），胃適蛋白質的主要消化場所，依次是肝胰臟和腸，在腸中，中腸消化酶活性強于前腸，是蛋白質的主要消化場所，詳見表1和圖3。

圖1　pH值對肝胰臟和胃中蛋白酶活性的影響

圖2　pH值對前和中腸中蛋白酶活性的影響

表1　白斑狗魚不同消化器官中蛋白酶的活性

圖3　白斑狗魚不同消化器官中蛋白酶的活性

3　討論

3.1　越冬與蛋白酶

該試驗所采用的是越冬期間的白斑狗魚，在最適宜pH值條件下，肝胰臟蛋白酶：13.923 U/(min·g)；胃蛋白酶活性為：26.056 U/(min·g)；前腸蛋白酶、6.89 U/(min·g)；中腸蛋白酶：7.856 U/(min·g)；從魏永星等人[9]的研究結果可知，白斑狗魚越冬期間，其蛋白酶活性依然很強，因此可以得出結論，白斑狗魚在越冬期仍正常進食。

3.2　越冬期飼料及投喂

上述試驗結果表明，越冬期，在適宜的pH值條件下，白斑狗魚其消化系統蛋白酶活性依然很強，就此可以根據越冬環境溫度變化及狗魚采食活躍程度，采用目前常規飼養模式及飼料，制定相應的投喂方式開展越冬期投飼，以此提高其增重率，進而提高越冬成活率。同時探索人工配合飼料養殖技術及應用，探索最佳配合飼料營養配比，為人工冬季養殖積累經驗。

3.3　白斑狗魚不同消化器官中蛋白酶的最適pH

在不同pH值條件下，胃、肝胰臟、前腸和中腸蛋白酶的最適宜pH值分別為4.0、4.5、7.5和7.5。

白斑狗魚在越冬期仍正常進食，堅持冬季合理投飼，以此提高其增重率，提高越冬成活率。