PCR-DHPLC檢測方法在病毒性出血性敗血病診斷中的應(yīng)用

吳斌，蘇立明，肇慧君，蔡曉萍，關(guān)鵬

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧　大連　116001；2.中檢集團遼寧公司，遼寧　大連　116001）

病毒性出血性敗血病（Viral haemorrhagic sep ticaemia，VHS）是由彈狀病毒引起鮭、鱒、狗魚和大菱鲆等十多種魚類的一種烈性傳染病，表現(xiàn)為出血性敗血癥，致死率達到90%以上[1]。該病主要流行于北半球，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）必須申報的疫病[2]，我國將其列為二類疫病。

目前國際上檢測VHSV通常采用的方法是細胞培養(yǎng)分離病毒法，血清學方法、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法[3]以及酶聯(lián)免疫吸附試驗[4]。細胞培養(yǎng)分離VHSV法結(jié)果可靠，但是檢測周期長，不適用于快速、高通量集成化鑒別診斷的要求。該試驗首次將RT-PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）應(yīng)用于病毒性出血性敗血病病毒（VHSV）的檢測，以達到快速、準確、高通量集成化檢測的目的。DHPLC是利用樣品分子通過離子對固定相親和力的差異，在用流動相洗脫時，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移動速率不同而達到分離的目的[5]。

1　材料與方法

1.1　病毒和細胞系

病毒性出血性敗血病病毒（VHSV）、傳染性造血組織壞死病病毒（IHNV）、傳染性胰臟壞死病病毒（IPNV）、鯉春病毒（SVCV）和鯉魚上皮瘤細胞系（EPC）均由遼寧出入境檢驗檢疫局實驗室保存。

1.2　主要試劑

PCR相關(guān)試劑購自寶生物工程（大連）公司PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司，三乙胺乙酰鹽（TEAA，色譜純）購自Transgenomic公司，乙腈（色譜純）購自Fisher公司。DHPLC緩沖液：緩沖液A為0.1 mmol/L TEAA；緩沖溶液B為0.1 mol/L TEAA+25%乙腈。

1.3　主要儀器

變性高效液相色譜儀器（Transgenomic Wave 4500）為北京環(huán)球基因公司產(chǎn)品；Allegra TM21R高速冷凍離心機為Beckman Coulter公司產(chǎn)品；ES-2全波長紫外可見光分析系統(tǒng)為日本Malcom公司產(chǎn)品。

1.4　引物設(shè)計

選取病毒性出血性敗血癥病毒的糖蛋白（glycoprotein）基因序列 ,針對病毒的高保守區(qū)域,用Primer Explorer V3軟件設(shè)計兩條特異性引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.5　RT-PCR擴增反應(yīng)

首先用Trizol法從增殖的病毒液中提取病毒的RNA，再用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對病毒RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，在PCR管中加入提取出的RNA模板5 μL、2 μL dNTP、0.5 μL RNA 酶抑制劑（20 U）、5 μL 的 5 倍逆轉(zhuǎn)錄酶濃縮緩沖液、1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（10 IU），加 DEPC 水至 25 μL。42 ℃反應(yīng) 60 min，合成cDNA。

對合成好的cDNA進行RT-PCR擴增，反應(yīng)條件為：引物 F1 和 R1 各 1 μL、10 倍緩沖液 5 μL、Taq DNA 聚合酶 5 U、dNTP 2 μL（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmol/L），總反應(yīng)體系總體積為50 μL。反應(yīng)條件：94℃變性 5 min；94℃變性 30 s，55℃40 s退火，72℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72℃，8 min，4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

用1.5%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳分析，回收目的片段（大小為811 bp），將目的片段與pMD18-T載體連接，連接好的重組質(zhì)粒在感受態(tài)細胞DH5α中進行轉(zhuǎn)化，用OMEGA Kit試劑盒對增殖的菌液進行重組質(zhì)粒pMD18-T-VHSV-Sp抽提，測序鑒定。將測序結(jié)果與GENBANK上公布的多株VHSV核苷酸序列進行同源性比對分析。

1.6　PCR擴增產(chǎn)物的DHPLC分析

DHPLC分析條件：該試驗采用PS-DVB&C18DNASep色譜柱（4.6 mm×50 mm，粒度 3 μm），將PCR產(chǎn)物放入DHPLC進樣室，上樣量為5 μL。預(yù)先設(shè)定基因片段大小為100~700 bp，檢測起始時間為0.5 min，洗脫液起始濃度為緩沖液 A液50.2%，B液49.8%；洗脫液由緩沖液A（0.1 mol/L三乙胺乙酰鹽）和緩沖液B（0.1 mol/L三乙胺乙酰鹽和25%乙腈）組成，柱溫50℃，結(jié)束時間為10 min，洗脫液終止?jié)舛葹榫彌_液A液50.2%，B液49.8%；流速為0.9 mL/min，用紫外檢測器在波長260 nm處獲得吸光度值，經(jīng)系統(tǒng)處理后，形成DHPLC峰型圖譜，進行分析鑒定。

1.7　實時熒光PCR檢測

首先確立熒光PCR的最佳反應(yīng)條件，分別對反應(yīng)體系中引物和探針濃度、鎂離子濃度、DNA聚合酶濃度、退火溫度及循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，建立了如下反應(yīng)體系為：RNA模板10 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液（Mg2+，15 mM）5 μL，0.25 μL dNTP，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）0.25 μL，DNA 聚合酶（5 U/L）0.25 μL，上下游引物（10μM）各 1.5 μL，最后用DEPC水補足至總反應(yīng)體積25 μL。在LC 480熒光PCR儀上進行PCR擴增，反應(yīng)條件：42℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min 40個循環(huán)。

1.8　PCR-DHPLC檢測的特異性分析

分別提取 VHSV、IPNV、IHNV、SVCV 的 RNA，以其為模板按照RT-PCR條件進行擴增反應(yīng)，同時設(shè)立滅菌水為空白對照，對擴增結(jié)果進行DHPLC分析。對其擴增結(jié)果進行鑒定，觀察是否有交叉反應(yīng)，分析該方法的特異性。

1.9　PCR-DHPLC與實時熒光PCR的靈敏度試驗

將提取的VHSV的RNA用紫外分光光度計測其在260 nm波長處的OD值，計算RNA的濃度為3×105pg，將其進行10倍梯度系列稀釋，得到模板質(zhì)量濃度分別為：3×105pg、3×104pg、3×103pg、3×102pg、3×101pg、3×100pg、3×10-1pg，分別應(yīng)用PCR-DHPLC與實時熒光PCR進行同步檢測,確定并比較兩種檢測方法的檢測限。

2　試驗結(jié)果

2.1　RT-PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

將病毒性出血性敗血癥病毒的RT-PCR的擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果通過DANSTAR序列比對軟件與GENBANK上公布的多株VHSV核苷酸序列進行同源性比對分析。同源性均在96%以上，說明RT-PCR擴增所得片段為該病毒的特異性擴增產(chǎn)物。

圖1　病毒性出血性敗血癥病毒的DHPLC檢測圖譜

2.2　PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DHPLC檢測結(jié)果

RT-PCR擴增后，將擴增產(chǎn)物經(jīng)DHPLC分析，5個平行試驗均在10.2 min左右出峰時間出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，且重復(fù)性很好，如圖1所示。

2.3　PCR-DHPLC檢測的特異性試驗結(jié)果

四種病毒均在相同條件下進行RT-PCR擴增后，用DHPLC檢測，設(shè)置100~900 bp的相同檢測模式下進行分析，病毒性出血性敗血癥病毒在10.2 min左右的出峰時間檢測到了其陽性特征吸收峰，其他三種病毒經(jīng)檢測后在DHPLC分析圖譜中均未出現(xiàn)明顯的吸收峰。如圖2所示。

圖2　病毒性出血性敗血癥病毒特異性試驗的DHPLC檢測圖譜

2.4　實時熒光PCR檢測結(jié)果

采用針對病毒性出血性敗血癥病毒設(shè)計的探針及引物對四種病毒在相同反應(yīng)條件下進行實時熒光PCR檢測，如圖3所示，只有病毒性出血性敗血癥病毒出現(xiàn)特異性擴增曲線，其他三種病毒均無擴增曲線。

圖3　實時熒光PCR特異性檢測結(jié)果

2.5PCR-DHPLC與實時熒光PCR的靈敏度試驗結(jié)果

2.5.1PCR-DHPLC的靈敏度檢測結(jié)果由圖4所示，經(jīng)10倍梯度系列稀釋的7個稀釋度樣品，在DHPLC分析圖譜中，最低為3 pg的模板量可出現(xiàn)特征峰。

2.5.2實時熒光PCR靈敏度檢測結(jié)果由圖5所示，5 pg的病毒核酸也出現(xiàn)了“S”型擴增曲線，表明實時熒光PCR的檢測限為3 pg，由于加入了一條特異性的熒光探針，使其比普通的PCR在檢測靈敏度上高出很多。

3　結(jié)論

圖5　實時熒光PCR靈敏度檢測結(jié)果

病毒性出血性敗血癥是一種能夠感染鮭鱒魚類的烈性傳染性疾病，主要通過水體擴散傳播病毒，在自然條件下受感染的病魚會通過糞便、尿液等排泄物迅速感染周圍魚類[6]。目前國際上檢測病毒性出血性敗血癥病毒通常采用的方法是細胞培養(yǎng)分離病毒法、血清學方法、以及酶聯(lián)免疫吸附試驗[4]。細胞培養(yǎng)分離VHSV法結(jié)果可靠，但是檢測周期長，不適用于快速鑒別診斷，因為VHSV是有囊膜的彈狀病毒，在用酶聯(lián)免疫吸附試驗對其進行檢測時容易與其他魚類彈狀病毒有交叉反應(yīng)，進而影響到診斷的準確性。

圖4　PCR-DHPLC靈敏度檢測結(jié)果

目前反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）是檢測該病毒比較常用的檢測方法。但是普通PCR需要結(jié)合電泳和紫外光成像系統(tǒng)來判定擴增結(jié)果，這不僅使得操作繁瑣，檢測中還需要接觸到溴化乙錠、紫外燈，在一定程度上對操作者造成危害，電泳很難檢測出模板拷貝數(shù)較低的病毒核酸，這可能會產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象。熒光PCR檢測方法有著高靈敏度的特點，但是成本較高。為了簡化檢測步驟降低檢測成本提高準確性以適應(yīng)高靈敏度高通量集成化的診斷要求，該試驗建立了RT-PCR與DHPLC相結(jié)合的檢測方法，該方法將RT-PCR的擴增產(chǎn)物用變性高效液相色譜儀進行檢測，最低可檢測出3 pg的核酸模板，其檢測限高于普通PCR兩個數(shù)量級[7]，與熒光PCR的最低檢測量一致，并且不需要設(shè)計熒光探針，降低了檢測成本，試驗結(jié)果表明該方法特異性較高，與其他彈狀病毒無交叉反應(yīng)，DHPLC特征圖譜可精確到幾個堿基的差異[8]，一次進樣可自動檢測數(shù)百個樣品，滿足了檢測的高通量自動化的要求。綜上所述，該方法可應(yīng)用于進出口岸貿(mào)易及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對VHSV的快速檢測。