血管緊張素Ⅱ受體抑制劑對去卵巢骨質疏松小鼠腰椎骨組織的影響及可能機制

唐 林，韋敏克，韋建勛，柳 達

1.廣西壯族自治區人民醫院骨科，廣西壯族自治區 530021

2.中國醫科大學附屬第四醫院骨科，遼寧 110000

絕經后骨質疏松作為絕經后女性的常見病和多發病，發生率呈逐年升高趨勢，嚴重威脅女性健康［1］。該病是由于雌激素缺乏而導致骨代謝異常的一種全身性骨骼疾?。?］。腎素-血管緊張素系統（RAS）作為機體重要的體液調節系統，廣泛存在于人體多種器官、組織中，廣泛參與機體多項生理功能［3］，血管緊張素Ⅱ作為RAS主要的活性肽類物質，可與其受體結合在心血管疾病、先兆子癇、血管排斥反應等多種生理病理過程中發揮重要作用［4］。近年來研究發現，RAS組分存在于骨組織中，且在骨骼代謝、骨細胞增殖等過程中發揮重要作用［5］。Shuai等［6］指出，腰椎椎間盤突出癥患者腰椎骨小梁中存在RAS組分，且與骨密度和骨代謝密切相關。本研究擬對去卵巢骨質疏松小鼠進行血管緊張素Ⅱ受體抑制劑干預，探討其對腰椎骨組織的影響及可能的機制，以期為絕經后骨質疏松防治提供依據。

1　材料與方法

1.1　材料和設備

氯沙坦購自揚子江藥業集團四川海蓉藥業有限公司（國藥準字H20080371），小鼠雌二醇檢測試劑盒、反轉錄和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（PICP）檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；小鼠骨鈣蛋白（OCN）檢測試劑盒購自北京冬歌生物科技有限公司；血清鈣檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；TRIzol總RNA提取試劑盒購自Gibco公司；骨保護素（OPG）、核因子κB受體活化因子（RANK）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）及內參引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成；酶標儀購自美國BioTek公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.2　實驗動物

SPF級雌性小鼠（Balb/c）60只購自河南省實驗動物中心［合格證號SCXK（豫）2010-0002］，8周齡，體質量（21.2±2.0）g。利用隨機數字表將小鼠分為假手術組、模型組和氯沙坦治療組，每組20只。3組小鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位固定，無菌操作，取背側正中切口，模型組和氯沙坦治療組均將雙側卵巢結扎切除，假手術組只切除雙側卵巢周圍與卵巢等重的脂肪組織。術后第5天起對小鼠進行陰道涂片，每日1次，持續5 d，以未發現角化作為建模成功［7］。術后第7 天開始假手術組和模型組小鼠每天灌服0.5 mL生理鹽水，氯沙坦治療組小鼠按照10 mg/（kg·d）的劑量灌服氯沙坦水溶液0.5 mL［8］。3組小鼠術后均未用抗生素，自由活動，喂養于相同條件下，連續處理至術后12周，均未出現死亡。

1.3　小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平檢測

各組小鼠分別于建模后8周和12周時采血，采血前10 h禁食但不禁水。各組小鼠均于內眥靜脈叢采血0.4 mL，室溫下靜置60 min，3 000 r/min離心10 min，留取血清保存于-30℃冰箱以備檢。利用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）對血清中雌二醇、ALP、OCN和PICP水平進行檢測，所有操作均在標準實驗室按照試劑盒說明完成。

1.4　小鼠腰椎骨形態計量學檢測和三維形態重構

各組小鼠均于建模后12周取血后采用頸椎脫臼法處死，將下段腰椎取出，除去肌肉及軟組織，利用美國GE公司Micro-CT三維成像系統對小鼠L4椎體進行骨形態計量學檢測和三維形態重構。分析指標包括骨密度（BMD）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁體積分數（BV/TV）、骨小梁間隙（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、結構模型指數（SMI）。

1.5　小鼠腰椎組織中OPG、RANK和RANKL表達檢測

取各組小鼠L5椎骨組織，研磨成粉末狀后轉移至勻漿器中，加入TRIzol總RNA提取試劑，冷凍勻漿后，置于滅菌離心管中，室溫下于320×g（g=9.806 65 m/s2）離心6 min，取上清。加入氯仿，充分混勻，靜置2 min，于4℃條件下12 000×g離心10 min，取上清，加入異丙醇，混勻，于-20℃冰箱放置15 min，于4℃條件下12 000×g離心10 min，獲得白色沉淀即為RNA。取白色沉淀，加入75%乙醇，于4℃條件下12 000×g離心5 min，去除液體，將離心管放置在超凈臺上吹4 min，加入無RNA酶的水對RNA進行溶解。利用紫外分光光度計對總RNA純度進行檢測，取D260/D280≥1.80作為合格樣品。利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，以cDNA作為模板進行PCR。引物序列見表1。PCR反應條件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，連續進行40次循環。每個樣品均設置3個平行反應復孔。用2-△△Ct法 獲 得 小 鼠 腰 椎 組 織 中OPG、RANK和RANKL相對表達量［9］。

表1　引物序列Tab. 1 Primer sequence

1.6　統計學處理

利用SPSS 21.0軟件對數據進行整理和分析，數據以表示，3組間比較采用F檢驗，如組間差異有統計學意義，采用LSD法進行兩兩比較。不同時間點資料比較采用重復測量資料的方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2　結　果

2.1　3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較

3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平見表2。與假手術組相比，模型組和氯沙坦治療組小鼠8周、12周時血清雌二醇水平均降低；模型組小鼠8周、12周時血清ALP、OCN和PICP水平均升高；氯沙坦治療組小鼠8周時血清ALP、OCN和PICP水平均升高；差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，氯沙坦治療組8周、12周時小鼠血清ALP、OCN和PICP水平差異均降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。與8周時相比，模型組12周時血清ALP、OCN和PICP水平均升高，氯沙坦治療組12周時血清ALP、OCN和PICP水平均降低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。

2.2　3組小鼠腰椎Micro-CT掃描結果比較

3組小鼠腰椎Micro-CT掃描結果見表3。與假手術組相比，模型組和氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均降低，而Tb.Sp和SMI均升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。與模型組相比，氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均升高，而Tb.Sp和SMI均降低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。三維重建圖像顯示，模型組小鼠腰椎骨微結構破壞，骨小梁變疏松，連接性變差，多呈棒狀結構，局部出現較大空隙；氯沙坦治療組小鼠腰椎骨微結構改善明顯，骨小梁數量增多，排列平行，孔隙減少（圖1）。

表2　3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較Tab. 2 Comparison of serum levels of estradiol，ALP，OCN and PICP between 3 groupsn=20，

表2　3組小鼠血清雌二醇、ALP、OCN和PICP水平比較Tab. 2 Comparison of serum levels of estradiol，ALP，OCN and PICP between 3 groupsn=20，

注：*與假手術組相比，P＜ 0.05；△與模型組相比，P＜ 0.05；▲與8周時相比，P＜ 0.05Note：*P＜ 0.05，compared with sham group；△P＜ 0.05，compared with model group；▲P＜ 0.05，compared with 8 weeks

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表3　3組小鼠腰椎Micro-CT分析參數Tab. 3 Micro-CT analysis parameters of lumbar spine in 3 groupsn=20，

表3　3組小鼠腰椎Micro-CT分析參數Tab. 3 Micro-CT analysis parameters of lumbar spine in 3 groupsn=20，

注：*與假手術組相比，P＜ 0.05；△與模型組相比，P＜ 0.05Note：*P＜ 0.05，compared with sham group；△P＜ 0.05，compared with model group

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圖1　3組小鼠L4Micro-CT掃描三維成像Fig. 1 Micro-CT scan three-dimensional imaging of L4

2.3　3組小鼠腰椎組織中OPG、RANK、RANKL表達比較

3組 小 鼠 腰 椎 組 織 中OPG、RANK、RANKL相對表達量見表4。與假手術組相比，模型組和氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達量均降低，而RANKL mRNA相對表達量和RANKL/OPG比值均升高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。與模型組相比，氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達量均升高，而RANKL mRNA相對表達量和RANKL/OPG比值均降低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。

3　討 論

絕經后骨質疏松的發生與女性絕經后雌激素水平下降有關，切除成年小鼠雙側卵巢后出現骨代謝異常、骨量丟失，其過程與女性絕經后骨代謝改變十分相似［9］。因此，本研究將8周齡小鼠雙側卵巢切除，建立骨質疏松動物模型。ALP作為反映骨代謝狀況的間接指標常用于骨形成及骨轉換的評價［10］，OCN是反映骨礦化形成的特異性指標［11］，PICP則是體現成骨細胞合成骨膠原能力及骨形成的特異性指標［12］。本研究顯示，模型組小鼠8周、12周時血清雌二醇水平均較假手術組降低，而血清ALP、OCN和PICP水平均升高，表明去除卵巢小鼠骨吸收大于骨形成。采用Micro-CT對3組小鼠腰椎進行掃描，模型組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均降低，而Tb.Sp和SMI均升高；三維成像顯示，模型組腰椎骨微結構破壞，骨小梁變疏松，連接性變差，多呈棒狀結構，局部出現較大空隙，這些改變均提示采取切除小鼠雙側卵巢的方法可成功構建骨質疏松模型。

表4　3組小鼠腰椎組織中OPG、RANK、RANKL表達比較Tab. 4 Comparison on expressions of OPG，RANK and RANKL in lumbar vertebrae between 3 groupsn=20，

注：*與假手術組相比，P＜ 0.05；△與模型組相比，P＜ 0.05Note：*P＜ 0.05，compared with sham group；△P＜ 0.05，compared with model group

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血管緊張素Ⅱ作為RAS關鍵性活化物質，可抑制成骨細胞中OPG基因表達，抑制ALP活性，減少礦化結節形成，顯著抑制成骨細胞礦化能力［13］。血管緊張素轉換酶抑制劑可部分改善去卵巢骨質疏松小鼠骨組織負轉換狀態［14］。雌激素可抵抗由血管緊張素Ⅱ活化而引發的骨代謝異常及骨丟失［15］。Zhang等［16］發現，利用腎素抑制劑阿利吉侖可通過骨骼中血管緊張素Ⅱ和緩激肽受體信號通路而對卵巢切除術誘導的骨質疏松小鼠骨小梁發揮保護作用。本研究采用血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦對小鼠進行灌胃處理，結果顯示，氯沙坦治療組12周時血清ALP、OCN和PICP水平均降低，說明氯沙坦灌服可在一定程度上抑制骨吸收。Micro-CT對3組小鼠腰椎進行掃描，相關參數分析顯示，與模型組相比，氯沙坦治療組BMD、Tb.N、BV/TV和Tb.Th均升高，而Tb.Sp和SMI均降低；三維重建圖像顯示，與模型組相比，氯沙坦治療組腰椎骨微結構改善明顯，骨小梁數量增多、排列平行、孔隙減少，進一步說明氯沙坦可有效改善去卵巢小鼠骨質疏松狀態，減少骨轉換導致的骨丟失。

有研究發現，OPG-RANKL-RANK系統在骨質疏松發生過程中扮演重要角色，OPG可阻斷RANKL與RANK結合，從而抑制破骨細胞形成，減少骨吸收，增加骨質和骨量［17］。亦有研究發現，血管緊張素Ⅱ可促進成骨細胞中RANKL基因表達，從而加速細胞活化、分化［18］。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組和氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達量均降低，而RANKL mRNA相對表達量和RANKL/OPG比值均升高；與模型組相比，氯沙坦治療組小鼠腰椎組織中OPG mRNA、RANK mRNA相對表達量均升高，而RANKL mRNA相對表達量和RANKL/OPG比值均降低。提示在使用血管緊張素Ⅱ受體抑制劑氯沙坦干預后，可通過活化OPG-RANKL-RANK系統，降低RANKL/OPG比值而減少破骨細胞生成及成熟，從而減少骨流失。

綜上所述，血管緊張素Ⅱ受體抑制劑可能通過促進骨形成和抑制骨吸收來減少負轉換導致的骨丟失，從而改善去卵巢骨質疏松小鼠腰椎骨組織骨質疏松狀態。