尼羅羅非魚1號染色體分離及文庫構建方法研究

耿　青，肖　煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，楊　弘

(1.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214081；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)原產于非洲，已成為我國主要養殖的淡水魚類之一。養殖過程中尼羅羅非魚的雄魚生長速率顯著高于雌魚，引起研究學者對羅非魚的性別調控的廣泛興趣。遺傳學研究發現，羅非魚的有絲分裂中期分裂相中存在一對中部著絲粒染色體，顯著大于其他染色體對，并命名為1號染色體，推測1號染色體可能存在性別決定基因[1-3]。1998年Kocher等[4]構建了尼羅羅非魚第一代遺傳連鎖圖譜，后續研究表明，圖譜上的部分分子標記與羅非魚的性別連鎖相關[5]。

目前，染色體的分離手段主要分為兩種：玻璃針分離法和激光切割法。上世紀80年代，研究者首次運用顯微玻璃針分離法來獲得果蠅唾腺染色體特異區域，并成功克隆報道[6]。這項技術打開染色體分離技術在動植物遺傳學應用研究的大門。同時，顯微玻璃針分離技術對操作人員的實驗操作要求較高，一定程度上限制該技術的進一步推廣應用。近年來，激光微束切割儀的出現，研究者創造出利用激光微束，通過計算機控制軌跡，切割目標染色體的方法[7-8]。將該方法與PCR技術結合，推動單染色體擴增及文庫構建的快速發展。目前，該技術相繼在人[9]、小麥[10]、大麥[11]、棉花[12]、楊樹[13]、山羊[14]等多種動植物的染色體顯微分離和文庫構建的研究中得到應用，但其在魚類研究中的相關報道很少。本研究利用激光顯微切割法收集尼羅羅非魚的1號染色體，通過特異性酶切、LA-PCR體外擴增、電泳回收、連接轉化、感受態細胞培養等步驟優化建立尼羅羅非魚1號染色體微克隆文庫的方法。為從尼羅羅非魚1號染色體上篩選特異性性別相關標記，開展分子輔助育種提供技術支撐。

1　材料與方法

1.1　材料

LMD 6000顯微操作系統為 Leica 公司產品，PHA、秋水仙素購自Sigma公司。蛋白酶 K、Sau3AI、T4連接酶等試劑均由TaKaRa公司提供。100 g左右的XY型尼羅羅非魚由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉養殖基地提供。

1.2　方法

1.2.1染色體標本的制備

參考人的植物血細胞凝集素(PHA)體內注射法[15]，按魚體重以10 μg/g的量向一條XY型尼羅羅非魚的胸鰭基部注射PHA(PHA為凍干粉制劑，以1 mg/mL的濃度溶解于滅菌的0.8% NaCl溶液中)28～30 h后，按魚的體重以2 μg/g 的劑量注射秋水仙素溶液(秋水仙素為凍干粉制劑，以0.2 mg/mL的濃度溶解于滅菌的0.8% NaCl溶液中)，1.5～2 h后將實驗魚解剖取出頭腎組織，置于盛有0.8% NaCl的培養皿中，清洗2次。在100目的過濾篩網上研磨頭腎組織，加入8 mL生理鹽水過濾沖洗后移入15 mL的離心管中，用吸管反復吹打至細胞分散，制成細胞懸液。將細胞懸液以1 000g的轉速離心 5 min，棄上清，收集底部沉淀。低滲處理：加入經37 ℃ 預溫的0.75 mol/L KCl溶液低滲處理30 min，使細胞膨脹。再次將細胞懸液以1 000g的轉速離心 5 min，棄上清，收集底部沉淀。預固定、一次固定和二次固定，按照普通核型制備條件進行[16]。制片:將預冷的POL膜載片放置成45 ℃角，從1 m高處滴片，每片滴加懸液2～3滴，再將膜載片放入70 ℃烘箱中放置30 s，干燥后用10%姬姆薩染色液染色30 min，然后用蒸餾水輕輕沖洗膜片，室溫晾干后于-20 ℃保存。

1.2.2目標染色體的顯微分離與收集

在LMD 6000激光顯微鏡的40倍物鏡下，找到60個分散良好的分裂相，依次做好定位標記。將物鏡調150倍油鏡后，通過定位尋找到1號染色體，激光照射消除周圍染色體和雜質，從中選出10對完整的1號染色體切下，保留于20 μL反應緩沖液(5 g/L蛋白酶K，1 ×T4 DNA連接酶緩沖液配制)的0.2 mL PCR管中。12 000g離心30 s，-20 ℃存放待用。

1.2.3蛋白酶K的消化與Sau3AI接頭的制備

將含1號染色體的0.2 mL PCR管置于37 ℃下溫育2 h，使蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75 ℃下20 min滅活蛋白酶K。參考Chen等[17]的接頭的制備方法，將100 μmol/L的19mer和23mer各1 μL加入到含58 μL dH2O的PCR管中，在PCR儀中90 ℃變性 2 min，55 ℃退火20 min，冷卻后加dH2O 140 μL，濃度為50 ng/μL.取10 μL加入90 μL 20 mmol/L ATP(1 ×T4 DNA連接緩沖液配制)至100 μL，制成接頭工作液。引物23mer和19mer由上?；瞪锛夹g公司合成，序列分別為23mer:5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3；19mer:5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′。

1.2.41號染色體的體外擴增

在去蛋白的染色體DNA中加入2 μLSau3AI(0.01 U/μL，1×T4 DNA連接酶緩沖液配制)，37 ℃酶切2 h，于70 ℃下20 min滅活Sau3AI酶。加入2 μL上述制備好的Sau3AI接頭(50 ng/μL)、1.5 U T4 DNA連接酶(3 U/μL)，16 ℃連接過夜(連接反應終體積為24.5 μL)，最后于70 ℃下20 min滅活連接酶。經上述酶切、連接后的單染色體即可進行PCR擴增。PCR反應的總體積為60 μL，6 μL 10×Taq酶緩沖液、4 μL MgCl2(25 mmol/L)、8 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL 19堿基引物(20 μmol/L)、0.5 μL TaqDNA聚合酶(5 U/μL)，無菌ddH2O補至60 μL。用ABI Veriti 96 Well 型PCR儀進行擴增，擴增程序：94 ℃變性5 min，35個循環94 ℃ 1 min→50 ℃ 1 min→ 72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸15 min。第1輪PCR擴增在酶切、連接單染色體DNA的同一PCR管中進行。第2輪PCR擴增從第1輪PCR產物中取2 μL作為模板，其他反應成分不變，PCR反應程序與上述方法相同，將35個循環降至20個循環。此步驟設基因組DNA為模板的陽性對照和嚴格不含染色體DNA的陰性對照。

1.2.5尼羅羅非魚基因組DNA的提取和純化

取1 μg基因組 DNA用Sau3AI酶 37 ℃酶切過夜，與陰性對照、陽性對照和單染色體LA-PCR第2輪的擴增產物一起在1.0%瓊脂糖凝膠低電壓電泳直到完全跑開。進行 Southern 印跡轉膜，以及地高辛(Digoxin)標記系統的非同位素雜交。用經EcoRI酶切、DIG 標記的尼羅羅非魚基因組 DNA 作為探針進行 Southern blot。具體操作步驟參照羅氏地高辛標記DNA和檢測試劑盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I)說明書。

1.2.6微衛星檢測

以1號染色體擴增產物為模板，基因組DNA為陽性對照，使用已在尼羅羅非魚基因組上定位的兩對微衛星引物UNH971和UNH106進行 PCR 檢測(表1)。PCR 反應體系含1 μL模板、0.4 μL(10 mmol/L) dNTP、1 U Taq 酶、1.5 μL(5 mmol/L)引物、2 μL 10×Buffer，用無菌水補足20 μL。PCR反應程序為:95 ℃預變性 5 min、95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃ 延伸30 s，共35個循環：72 ℃ 延伸10 min。反應完畢后，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

表1　兩對微衛星引物特征Tab.1　Two pairs of microsatellite primers’ characteristics

1.2.7單染色體微克隆文庫的構建

第二輪 LA-PCR 擴增產物采用天根DNA膠回收純化試劑盒回收純化，取1 μL與pGEM-T Easy Vector(Promega)載體連接，采用熱擊轉化法將重組片段導入感受態細胞JM109中，并將轉化菌涂于含有氨芐青霉素(Amp)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的LB平板上37 ℃培養過夜，計算 6個板的陽性克隆數。在超凈工作臺上挑取白斑菌于LB培養基中并加入15%甘油于-80 ℃下長期保存。從文庫中隨機選取部分重組克隆子并采用TaKaRa質粒提取試劑盒提取質粒。以19堿基引物對部分重組克隆子進行擴增，其中20 μL擴增體系：2.0 μL 10×Taq Buffer(含Mg2+)、4 μL dNTPs(2.5 mmol/L )、1 μL 19堿基引物(10 μ)、0.5 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL )、質粒0.5 μL和 ddH2O 1 μL；PCR 擴增程序：94 ℃ 預變性 5 min，94 ℃ 變性 1 min，58 ℃復性 45 s，72 ℃延伸 2.5 min，共 30 個循環，72 ℃總延伸 8 min。擴增結束后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2　結果與分析

2.1　染色體的識別與標本制備

對尼羅羅非魚60個分散清晰的細胞中期分裂相進行計數，如表2，其染色體數目主要是在39～44之間，其中80%的染色體數目為44。因此尼羅羅非魚染色體數是2n=44。

表2　從60個細胞計算出的尼羅羅非魚前中期染色體的數目Tab.2　Distribution of chromosome numbers in 60 metaphases cells from O.niloticus

2.2　染色體的顯微切割

在切割過程中，激光器的能量越高，越易造成切割部位染色體的灼傷，激光器的能量過低，切割越困難。因此切割時需要依據不同部位調整能量，以確保可以切割下來又不會造成染色體灼傷。經過反復實驗表明，采用萊卡公司LMD 6000激光顯微切割系統，當激光輸出值為20～40，速度為2～4，能取得較好的切割效果，樣品損傷光斑直徑可小于1 μ。圖1為激光顯微切割前后的染色體對比圖，從圖中可以看到分離了完整的一對1號染色體。

圖1　尼羅羅非魚中期染色體及1號染色體的分離Fig.1　The metaphase chromosome and chromosome 1 separation in O.niloticus

2.3　1號染色體的體外擴增

圖2為第2輪擴增的結果， 二次分離的1號染色體擴增產物片段大小均為250～2 000 bp，尼羅羅非魚基因組DNA為擴增模板的陽性對照所得產物片段，較1號染色體擴增產物的范圍寬，陰性對照未出現擴增信號，說明沒有外源DNA的污染。

圖2　LA-PCR第2輪擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Image of agarose gel electrophoresis of the LA-PCR 2nd round amplification’s products

2.4　Southern blot驗證

用經Sau3AI酶切、DIG 標記的尼羅羅非魚基因組 DNA 作為探針對 LA-PCR 第二輪擴增產物進行Southern blot 驗證，結果如圖3。陽性對照、Sau3AI酶切的基因組DNA和單染色體擴增產物都有明顯的雜交信號，而陰性對照則沒有出現。結果表明，單染色體的擴增產物確實來自尼羅羅非魚的基因組。

圖3　Southern blot驗證Fig.3　Verification with Southern blot

2.5　SSR檢測

已定位在尼羅羅非魚基因組上的 SSR 引物對擴增產物進行 PCR 分析，結果顯示引物對UNH971，UNH106從1號染色體的擴增產物中能夠擴增出目的條帶(圖4)。這表明單染色體擴增產物確實是來自尼羅羅非魚基因組，本試驗對尼羅羅非魚1號染色體的分離和擴增是成功的。

圖4　SSR引物對單染色體擴增產物的 PCR分析結果Fig.4　Results of PCR analysis on single chromosomes 1 amplification products of SSR primers

2.6　尼羅羅非魚1號染色體質粒文庫的構建立

尼羅羅非魚1號染色體第 2 輪LA-PCR 擴增產物純化回收后與 pGEM-Easy Vector連接，采用熱擊轉化法將重組片段導入JM109感受態細胞并將轉化菌涂于含有Amp、IPTG和 X-gal 的6個LB平板上37 ℃培養過夜，均長出密度適中的白色菌落，平均每板約有146個陽性克隆。19mer引物擴增部分重組質粒，1.0%凝膠電泳檢測結果如圖5顯示，克隆片段長度分布在300～600 bp，平均為400 bp左右。

圖5　部分重組質粒經19mer引物擴增后電泳結果Fig.5　Electrophoresis results of some recombinant plasmid with 19mer primer

3　討論

3.1　尼羅羅非魚染色體標本制備過程中的操作優化

魚類染色體的研究已有半個多世紀，累積了多樣化的染色體標本制備方法。本研究主要在原先的體腔注射PHA空氣干燥法上做了細微調整[18]，將原先7 h內的PHA作用時間延長至28～30 h，制得較理想的染色體標本。魚體內注射適量的PHA可以起到增加細胞中期分裂相數目的作用[19]，但因養殖溫度、注射劑量和注射時間等多種因素的影響也會導致細胞分裂相數量不足或直接導致試驗魚死亡。經反復摸索發現羅非魚水溫在20～25 ℃時，按魚體重以10 μg/g的量注射1 mg/mL的 PHA，暫養28～30 h后得到的處于分裂中期的頭腎細胞較多。羅非魚染色體較小，長度只有2～5 μm，需按魚體重以2 μg/g的量注射0.2 mg/mL的秋水仙素，秋水仙素作用時間控制在1.5～2 h，不宜過長。作用時間過長，則易導致染色體收縮過度，呈點狀，影響染色體的形態。在低滲中將時間延長至1 h，每隔10 min上下輕輕翻動離心管數下，使細胞充分懸浮并膨脹?？ㄖZ氏固定劑中冰醋酸具有脫嘌呤作用[20]，為避免染色體DNA受損，需把卡諾氏固定劑中的甲醇、冰乙酸的比例調整為4∶1，且每次固定時間縮短為15 min，有利于減小對染色體的傷害，保證染色體的完整性，并獲得背景干凈、染色體分散的標本。此外，膜片的制備與普通玻片不同，膜片不能使用酒精燈火焰加熱。本團隊摸索出滴片后，將膜片放在55 ℃烘箱中烘干10 s的方法，成功制備出高質量的有絲分裂中期染色體膜片。膜片材質極其輕薄，在操作時要小心謹慎，輕微的觸碰都會使膜破裂。

3.2　單染色體顯微分離技術優化

激光顯微分離染色體和手工分離染色體是顯微分離單條染色體的方法。手工分離染色體對操作者的熟練度具有較高的要求，同時容易出現機械接觸，造成污染[21]。而染色體微分離、微克隆研究中應嚴格避免外源污染[22]，本研究采用Leica LMD 6000正文激光顯微切割系統，染色體滴片在POL類型的鋼化薄膜上，用激光切割目標染色體，在重力作用下脫落進入收集管中。此操作不需借助外力，沒有人為接觸，避免了人為污染[23]。使用激光顯微系統分離單染色體，對目標染色體進行可視化切割，具有更高的準確度，并能快速獲得大量染色體或染色體片段。本團隊研究發現目標染色體周圍有其它染色體或細胞核成分時，可先通過微弱能量的激光束將干擾成分剔除 。若切割后發現被切下的承載目標染色體的膜粘附在載片膜的背面時，需適當增加激光能量輸出值，增大激光光圈，并降低激光發射速度，使其直接脫落在下方備好的收集管中。尼羅羅非魚的染色體屬于中、小型染色體，要比大部分細菌還小，為避免外源DNA的污染，LA-PCR擴增等操作過程需在超凈工作臺內完成，并對所用試劑、水進行嚴格的無菌處理，嚴禁有任何的污染影響實驗。

3.3　染色體文庫的驗證與分析

擴增產物經限制性內切酶Sau3AI酶切，并用地高辛(DIG-High Prime)標記尼羅羅非魚基因組 DNA 為探針，對擴增產物進行Southern blot 雜交驗證。本實驗的Southern 雜交結果顯示擴增產物來自尼羅羅非魚基因組，且陰性對照沒有出現信號，證明本實驗沒有被污染。此外，本研究應用第二代羅非魚遺傳連鎖圖上定位的微衛星做引物，并成功地在分離的1號染色體擴增產物上擴增出目的條帶。微衛星標記具有高度特異性[24]，進一步說明分離的1號染色體擴增產物來源的真實性。

本研究從尼羅羅非魚頭腎細胞入手，運用單染色體的微分離與微克隆技術，成功建立尼羅羅非魚1號染色體的微克隆文庫構建的方法，為該染色體的特異探針篩選及性別相關基因定位提供新的思路與方法，進一步為更好地開展尼羅羅非魚分子輔助育種提供技術支撐。