pH與氨氮對黃顙魚幼魚生長與肝臟超氧化物歧化酶的影響

崔　平，強　俊

(1.無錫職業技術學院，江蘇無錫，214121；2.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水漁業和種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081)

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)又名江黃顙，主要分布于長江及其支流中。分類上隸屬于鯰形目黃顙魚屬，是該屬中個體最大的一個種。該魚肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富、少肌間刺，是當前我國重要的水產養殖品種之一，產量逐年增加[10]。水環境中，pH與氨氮對水生生物的影響存在相互聯系、相互制約的關系。然而，關于pH與氨氮對黃顙魚幼魚生長與肝臟抗氧化指標之間是否存在互作效應尚未見到相關報道。本研究在已有研究的基礎上，選取pH與氨氮兩個重要水環境影響因子，采用中心復合實驗設計(central composite design，CCD)與響應曲面分析方法(response surface method，RSM)研究了不同pH與氨氮(ammonia nitrogen，AN)組合對瓦氏黃顙魚生長、飼料系數與超氧化物歧化酶活性的影響。近年來，CCD和RSM逐漸開始應用于水產養殖實驗，如羅非魚(Oreochromisniloticus)的人工授精與孵化技術與養殖條件的優化等[11-13]。本研究不僅可以解析水體中不同pH與氨氮對黃顙魚生長與生理的變化規律，還能為實際生產中優化其養殖條件，降低脅迫對其生長的抑制作用提供科學依據。

1　材料與方法

1.1　實驗用魚

瓦氏黃顙魚選自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興繁育基地。選擇健康且活力良好的魚。將實驗用魚放置在室內水泥池(水溫(27±0.3) ℃，pH 7.4～0.2)中暫養10 d，增氧機持續增氧，自然光周期。暫養期間，每天投喂沉性飼料2次，飼料中主要包含粗蛋白質38%，粗脂肪5%，粗纖維12%，粗灰分15%，水分12%，總磷1%，鈣1%。

1.2　實驗設計與分組

正式實驗前，通過查閱文獻與預實驗，確定能夠抑制黃顙魚生長的氨氮濃度[14]。正式實驗采用CCD設計，響應值分別為特定生長率(specific growth rate，SGR)，飼料效率(feed efficiency，FE)與肝臟超氧化物歧化酶活力(superoxide dismutase，SOD)。設計兩個實驗因子：pH(5～10)和氨氮(0.1～6.5 mg/L)，分別用pH和AN字母表示。分為2因素5水平，計算機編碼分別為-a，-1，0，1，a(表1)，共計13個實驗組。中心組合(計算機編碼：0和0)重復5次，每次實驗組合各設置3組平行。pH和AN的組合如表1所示。

1.3　實驗管理

實驗在39個塑料桶(0.8 m3)內進行。每個塑料桶加入曝氣3 d的自來水0.6 m3。通過HCl 或 NaOH 調節水體pH值，采用德國WTW photoFlex測定水體pH值。利用電子恒溫棒(量程為20～34 ℃)將水溫控制在(27.5±0.5) ℃。同時，配制1 g/L的氯化氨母液，按照表1中的實驗組合，配制相應的實驗濃度，使用奈氏試劑法測定與調整養殖水體的氨氮濃度。每個實驗組合中共放置75尾實驗魚(10.22±0.16) g，每個桶中各25尾。每天8∶00與17∶00各投喂1次，飼喂量為體重的1%～3%，實驗周期為7周。在整個實驗過程中，每3 d換水1/3，每隔6 h測定水中pH與氨氮濃度1次，及時調整濃度使其符合實驗要求。養殖期間通過增氧機連續增氧，自然光周期。同時，我們利用虹吸法每天清除桶底的殘餌與糞便。

表1　pH與氨氮濃度的試驗設計與結果Tab.1　Experimental design and results of pH and concentrations of ammonia nitrogen (mean±SD)

注:(1) a =1.414 21為星號臂值，中心點重復5次；(2)表中pH和AN分別為pH值與氨氮濃度。

1.4　取樣與分析

禁食24 h后，分別從每個養殖桶中隨機選取8尾魚稱重。SGR與FE的計算方法如下：

SGR=100%×[Ln(終末體重)-Ln(初始體重)]/養殖周期

FE=總攝食量/(終末體重-初始體重)

另外每個實驗桶隨機選取3尾魚(3組平行共計9尾實驗魚)，利用MS-222(200 mg/L)深度麻醉1分鐘后，解剖取其肝臟，放入-80 ℃冰箱中用于下一步的SOD活性檢測。肝臟SOD活性的測定采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，按照試劑盒中的說明進行操作。

1.5　數據分析

數據用平均值±標準差表示。基于響應面分析方法，使用最小二乘法擬合因子與響應值之間的二次多項式回歸方程：

2　結果

2.1　pH與AN對黃顙魚SGR的影響

pH與AN對黃顙魚SGR的影響見表1所示。通過最小二乘法進行回歸數據的擬合。模型擬合有效(P=0.081 6>0.05)。pH與AN的線性和二次效應對SGR具有顯著影響(P<0.05)。pH×AN的互作效應對SGR無顯著影響。pH與AN對SGR的實際二次多項式回歸方程為：

SGR=-8.654+2.688 3pH+0.085 8AN+0.006 9pH×AN-0.180 3pH2-0.039 7AN2(R2=0.94；校正R2=0.89)

SGR的響應面見圖1所示。通過動態曲面圖，可以評估實驗因子對黃顙魚生長的互作效應。水體AN為0.1～6.5 mg/L時，幼魚的SGR隨pH值的上升呈先上升后下降的變化趨勢。當pH為5～10時，幼魚的SGR在AN濃度為0.1～1.7 mg/L時無顯著差異；然而，AN濃度高于1.7 mg/L時，SGR顯著下降。pH和AN對SGR無互作效應(P>0.05)。

圖1　pH、氨氮濃度及其互作效應對黃顙魚幼魚特定生長率影響的等高線(A)和響應曲面(B)Fig.1　Contour plot (A) and its response surface plot (B) for the effects of pH and AN on specific growth rate of juvenile

2.2　pH與AN對黃顙魚FE的影響

采用ANONA分析表1中FE實驗結果，擬合模型的P值為0.001(P<0.05)，缺適性檢驗的P值為0.126 3(P>0.05)，表明FE擬合模型非常適合。pH的線性效應、AN的二次效應與pH和AN的互作效應對FE沒有顯著性影響。然而，AN的線性效應和pH的二次效應對FE有顯著影響。pH與AN對FE的實際二次多項式回歸方程為：

FE=-1.927 3+1.041 9pH-0.058 9AN+0.011 3pH×AN-0.071pH2-0.011 1AN2(R2=0.92；校正R2=0.83)

FE的曲線模型如圖2所示。pH為5～7.5時，幼魚的FE隨著水體AN濃度的升高(0.1～6.5 mg/L)呈顯著下降趨勢。pH高于7.5，AN在0.1～2 mg/L時，FE無顯著差異；然而，AN高于2 mg/L時，FE顯著下降。水體AN為0.1～6.5 mg/L時，FE在pH為7.5時擁有最高FE，升高或降低pH均會引起FE的下降。利用RSM對FE進行優化，當pH和AN的組合為7.2和1.0 mg/L時，FE值最高(1.71)，可信度為0.883。

圖2　pH、氨氮濃度及其互作效應對黃顙魚幼魚飼料效率影響的等高線(A)和響應曲面(B)Fig.2　Contour plot (A) and its response surface plot (B) for the effects of pH and AN on feed efficiency of juvenile

2.3　pH與AN對黃顙魚肝臟SOD活力的影響

SOD活力的測量結果見表1。方差分析顯示，SOD擬合模型方程有顯著差異(P=0.004 1<0.05)，模型的缺適性檢驗>0.05(P=0.089 3)。AN的線性效應與pH的二次效應對SOD有顯著影響(P<0.05)。pH的一次效應、AN的二次效應與pH×AN的交互效應對SOD無顯著差異。pH與AN對SOD的實際二次多項式回歸方程為：

SOD=-45.600 1+37.848 3pH-1.487 7AN-0.216 3pH×AN-2.437 6pH2+0.029 8AN2(R2=0.88；校正R2=0.79)

由圖3可以看出，水體pH為5～10時，黃顙魚肝臟SOD活力隨著AN的上升(0.1～6.5 mg/L)呈顯著的下降趨勢。當水體氨氮為0.1～2 mg/L，SOD隨著pH上升(5～8)而增加；pH高于8時，SOD活力顯著下降。高TAH環境下，低pH或高pH對黃顙魚肝臟SOD活力有明顯的抑制作用。

圖3　pH、氨氮濃度及其互作效應對黃顙魚幼魚肝臟超氧化物歧化酶活力影響的等高線(A)和響應曲面(B)Fig.3　Contour plot (A) and its response surface plot (B) for the effects of pH and AN on the activity of superoxide dismutase in juvenile

2.4　黃顙魚SGR、FE與肝臟SOD模型的優化

根據Montgomery[15]的方法，對不同pH與AN下的黃顙魚SGR、FE與肝臟SOD模型進行共同優化。pH與AN分別為7.5與1 mg/L時，黃顙魚的SGR、FE與肝臟SOD活力同時達到最高值，分別為1.47%/d，1.71和97.9 U/mg.prot，優化的可信度為0.836。

3　討論

已有研究顯示，水體中高氨脅迫下會明顯抑制烏鱧(Anarhichasminor)[18]、虹鱒(Scophthalmusmaximus)[19]、羅非魚[13]和大西洋比目魚(Hippoglossushippoglossus)[20]的生長。本研究中，當AN為0～2 mg/L時，黃顙魚的生長與飼料利用率無顯著抑制作用；然而，高AN濃度對黃顙魚的生長與FE有明顯的抑制作用。然而，Li等[21]利用3 g左右的黃顙魚(P.fulvidraco)實驗發現水體中高AN(5.7 mg/L)和低AN (0.01 mg/L)脅迫下時，黃顙魚的生長和存活率相比無顯著差異。魚體對AN脅迫的耐受力可能與其規格、品系與脅迫時間有關。本研究發現AN對SGR存在顯著的二次效應。pH=7.5，水體AN在1.7 mg/L時可以獲得黃顙魚最大SGR(1.49 %/d)，其可靠性為0.898。

環境脅迫下易引起魚體氧化應激，增加組織的氧化損傷，主要涉及肝臟與腦神經元中的N-甲基-D-天冬氨酸酯型谷氨酸受體的過度活化[22]，導致一系列活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)過度產生，引起蛋白質的破壞[23]。在正常情況下，魚體可以通過自身的抗氧化防御體系，如提高SOD，過氧化氫酶與谷胱甘肽過氧化物酶的活力來降低ROS對機體的損傷。本研究中，高AN與高pH或低pH環境對黃顙魚肝臟SOD活力有明顯的抑制作用，可能因為較強的應激脅迫使魚體的肝臟功能發生紊亂，降低了抗氧化防御能力，增加了氧化損傷，進而抑制了黃顙魚的生長。同時，pH的二次效應對SOD活力有顯著影響，當水體AN為1 mg/L，肝臟SOD活力在pH為7.7時最高，為98.07 U/mg·prot，其可靠性為0.871。