混飼對吡喹酮在草魚體內(nèi)藥動學(xué)和生物利用度的影響

胥　寧，楊移斌，劉永濤，董　靖，楊秋紅，艾曉輝

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430223)

吡喹酮(Praziquantel,PZQ)是一種廣譜抗寄生蟲藥物，廣泛應(yīng)用于人類和動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，吡喹酮主要對抗吸蟲[1]、棘頭蟲[2]、絳蟲[3]和其他類寄生蟲。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，用藥量也隨之增加。

在水產(chǎn)臨床應(yīng)用中，大多數(shù)藥物主要是通過拌飼給與水產(chǎn)動物，但是食物對藥物的代謝動力學(xué)和生物利用度影響研究還較為少見。在人類和畜牧動物中，有很多藥物與食物同時服用，對藥物的吸收、分布、排泄和代謝具有顯著的影響。在伏立康唑的研究中發(fā)現(xiàn)，藥物與食物同時服用使藥物的最高濃度(Cmax) 和藥時曲線下面積(AUC)，分別降低了22%和35%，生物利用度(F)降低了22%，而且明顯延遲了吸收時間[4]。哌醋甲酯在與食物混合服用時，藥動學(xué)數(shù)據(jù)也發(fā)生了明顯的改變。快速釋放的劑型的Cmax和AUC分別增加了23%和15%，慢速釋放劑型的Cmax和AUC分別增加了17%和14%[5]。一種葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶隨食物服用之后，Cmax增加了36%，AUC降低了14%，達(dá)峰時間延遲了2 h[6]。鹵方特瑞與脂肪食物混服之后，Cmax從184 μg/L增加到了1 218 μg/L，AUC從3.9 mg·h/L增加到了11.3 mg·h/L[7]。以上文獻(xiàn)顯示在混飼條件下，食物會改變腸道生理環(huán)境影響藥物的吸收、代謝和排泄，藥物的Cmax、 AUC、吸收速率和分布半衰期等參數(shù)受到了直接影響，致使藥物在動物體內(nèi)有效濃度發(fā)生變化，會導(dǎo)致藥物的藥效降低或升高，更有甚者會造成中毒和治療的失敗。因此，混飼條件下藥物代謝動力學(xué)的研究，直接關(guān)系到治療的成功和失敗，對藥物使用效率和安全使用具有重要的意義。

目前大多數(shù)水產(chǎn)藥的藥動學(xué)研究并沒有比較口服原藥和混飼藥物之間的區(qū)別[8,9]。本研究選取吡喹酮和草魚(Ctenopharyngodonidellus)為研究對象，采用口灌原形藥物和口灌原形藥物與飼料混合物，比較二者的藥代動力學(xué)參數(shù)的改變，為吡喹酮臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗儀器

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜(美國Waters公司)配熒光檢測Empower2 色譜工作站；電子天平(Mettler-TOLEDO AE-240，梅特勒-托利多公司)；高速冷凍離心機(jī)(20PR2520，日本日立)；漩渦混合儀(上海康華生化儀器制造公司)；氮吹儀(KD200，鞏義予華有限公司)。

1.2　藥物與試劑

吡喹酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司)，吡喹酮原料藥(純度大于98%，購自艾博科技有限公司)。乙腈、甲酸(純度88%)、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純(購自美國J.T.Baker公司)；肝素鈉(購自上海惠興生化試劑有限公司)。

吡喹酮原形藥物口灌液的配制：精確稱取10 mg吡喹酮原料藥，首先用適量的二甲亞砜進(jìn)行溶解(體積小于1%)，然后用生理鹽水調(diào)整到5 mg/mL。

吡喹酮與飼料混合物的配制：精確稱取10 mg吡喹酮原料藥，首先用適量的二甲亞砜進(jìn)行溶解(體積小于1%)，加入粉碎的飼料10 g，然后用生理鹽水調(diào)整到5 mg/mL。

吡喹酮注射液的配制：精確稱取5 mg吡喹酮原料藥，首先用適量的二甲亞砜進(jìn)行溶解(體積小于1%)，然后用生理鹽水調(diào)整到2 mg/mL。

1.3　試驗動物

草魚(Ctenopharyngodonidellus)300尾，體重(300.0±25.2) g，由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所基地提供，試驗前在5個水族箱內(nèi)(100 cm×60 cm×80 cm)暫養(yǎng)一周，飼喂不加抗菌藥物的草魚全價飼料。試驗用水為曝氣48 h自來水，連續(xù)充氧，保持水中溶氧大于5.0 mg/L，pH為7.5～8.0，溫度(21.0±1.3) ℃。

1.4　樣品采集

口灌吡喹酮原藥組：草魚84尾，試驗前禁飼24 h，以20 mg/kg灌胃給藥，灌胃之后觀察5 min，將回吐藥物的魚棄去，其他魚灌胃之后補(bǔ)足。給藥后于5、10、30 min、1、2、 4、6、8、12、16、24、48、72、96 h進(jìn)行血液的采集，每個時間點(diǎn)采集6尾魚。采集血液之后，1 500g離心，取上層血清-20 ℃保存。

口灌吡喹酮和飼料混合物(飼料配方為：米糠40%、麩皮38%、豆餅10%、魚粉10%和酵母粉2%)的實驗組實驗操作與上同。

靜脈注射組：試驗前禁飼24 h，草魚84尾，以5 mg/kg尾靜脈注射給藥，給藥之后按壓止血1 min。于給藥后5、10、30 min和1、2、 4、6、8、12、16、24、48、72、96 h進(jìn)行血液的采集，每個時間點(diǎn)采集6尾魚。血液采集之后1 500g離心，取上層血清-20 ℃保存。

1.5　樣品處理

在室溫下，將冷凍樣品自然解凍。準(zhǔn)確吸取血液1 mL于10 mL離心管中，依次加入4 mL乙酸乙酯，旋渦混合1 min，2 000g離心5 min。取上清液于另一10 mL離心管中。剩余殘渣再加入4 mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一遍，合并上清液。45 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL乙腈/水(35∶65，含0.1%甲酸)復(fù)溶，加入1 mL正己烷，旋渦混合30 s去脂，5 500g離心5 min，棄掉正己烷層，用1 mL注射器吸取樣品過0.22 μm尼龍膜放入1.5 mL樣品瓶中，待測定。

1.6　標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確度的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：配制吡喹酮的質(zhì)量濃度均為20、50、500、2 000和8 000 μg/L，進(jìn)行UPLC分析。分別以藥物峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，藥物濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密度和準(zhǔn)確度的測定：設(shè)定高中低三個藥物濃度(50、100、1 000 μg/L)，進(jìn)行基質(zhì)添加，然后用1.5方法處理之后，進(jìn)行測定計算回收率。基質(zhì)添加樣品分為5批，連續(xù)5 d測定計算精密度。

1.7　色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 column (1.7 μm，2.1×100 mm)

流動相：乙腈/水(0.1%甲酸)體積比(35∶65)，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃。

熒光檢測器，發(fā)射激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長280 nm。

1.8　數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線，藥物經(jīng)時曲線圖采用MicrosoftExcel2010軟件繪制；藥代動力學(xué)參數(shù)的擬合和計算，采用3P97軟件進(jìn)行處理。生物利用度的計算公式為：

AUCp.o.:口灌給藥后藥時曲線下面積；

Dosep.o.:口灌時給藥劑量；

AUCiv:靜注給藥后藥時曲線下面積；

Dosep.o.:靜注時給藥劑量。

2　結(jié)果

2.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度和精密度

吡喹酮出峰時間在6.45 min，在血液中的定量限為20 μg/L。在20～8 000 μg/L內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性，r=0.999，方程為y=101.67x-433.75。各個組織中高中低三個質(zhì)量濃度，吡喹酮的平均回收率在78.9%～86.2%之間，日內(nèi)和日間變異系數(shù)均小于10%。

2.2　吡喹酮在草魚體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)

口灌吡喹酮原形藥物：血藥濃度曲線符合一級吸收二室開放模型。在給藥之后，實測0.5 h達(dá)到濃度最高點(diǎn)為2 141.0 μg/L，隨后血藥濃度快速下降。其藥動學(xué)參數(shù)吸收速率常數(shù)(K)、吸收半衰期(t1/2K)、分布半衰期(t1/2)、消除半衰期(t1/2β)、表觀分布容積(Vd)和藥時曲線下面積(AUC)分別為6.51 h-1、0.1 h、1.2 h、18.1 h、2.49 L/kg 和 19 885.8 μg·h/L。生物利用度(F)為47.0%。

圖1　空白血液中添加標(biāo)準(zhǔn)品吡喹酮(1 μg/mL)的色譜圖Fig.1　Chromatogram of standard praziquantel (1μg/mL) added in blank blood

注：-不存在；A：為藥時曲線對數(shù)圖上在橫軸的截距；B：為藥時曲線對數(shù)圖上在縱軸的截距；a：為分布速率常數(shù)；β：為消除速率常數(shù)；Ke：一室模型消除速率常數(shù)；Ka：一室模型分布速率常數(shù)； t1/2α：二室模型吸收半衰期；t1/2β：二室模型消除半衰期；t1/2 Ke：一室模型消除半衰期；t1/2 Ka:一室模型分布半衰期；K10：由中央室消除的一級速率常數(shù)；K12：由中央室向周邊室轉(zhuǎn)運(yùn)的一級速率常數(shù)；K21：由周邊室向中央室轉(zhuǎn)運(yùn)的一級速率常數(shù)；AUC0-t：藥時曲線下面積；Tmax:達(dá)峰時間；Cmax：峰濃度；Vd：表觀分布容積；F：生物利用度。

口灌吡喹酮和飼料的混合物：血藥濃度曲線符合一級吸收二室開放模型。在給藥之后，實測1 h達(dá)到濃度最高點(diǎn)為2 167.0 μg/L，隨后血藥濃度快速下降，與口灌原形藥物比較較平緩。其藥動學(xué)參數(shù)K、t1/2K、t1/2、t1/2β、Vd和AUC分別為分別為2.19 h-1、0.3 h、0.4 h、8.6 h、0.01 L/kg和14 671.7 μg·h/L。F為34.7%。

靜注吡喹酮：血藥濃度曲線符合無吸收一室開放模型。其藥動學(xué)參數(shù)消除速率常數(shù)(Ke)、消除半衰期(t1/2Ke)、Vd和AUC分別為0.47 h-1、1.5 h、0.001 L/kg 和10 570.4 μg·h/L。

圖2　不同給藥方式下吡喹酮的血藥濃度曲線Fig.2　Praziquantel concentration curve in plasma after different administrations

3　討論

本研究在口灌吡喹酮原藥和口灌吡喹酮及飼料混合物所得血藥濃度均符合一級吸收二室開放模型，靜注所得血藥濃度符合無吸收一室開放模型。在淡水和鹽水的飼養(yǎng)條件下，草魚(Ctenopharyngodonidellus)口灌10 mg/kg吡喹酮，水溫(22±1) ℃，藥動學(xué)參數(shù)也符合一級吸收二室開放模型[10]。Tubbs 等[11]卻發(fā)現(xiàn)，無鰾石首魚(Seriolalalandi)口灌40 mg/kg，水溫為18～19 ℃條件下，血藥濃度符合非房室模型。文獻(xiàn)顯示，藥動學(xué)房室的擬合受到水溫、環(huán)境鹽度、魚的種類和大小等因素的影響[12]。

在口灌吡喹酮及飼料混合物和口灌吡喹酮原藥之后，Tmax和Cmax分別為1 h和2 167.0 μg/L，0.5 h和2 141.0 μg/L。口灌吡喹酮及飼料混合物，吡喹酮的達(dá)峰時間明顯延長，但是達(dá)峰濃度相差并不大。Xie等[10]報道，在口灌吡喹酮原藥10 mg/kg的條件下，達(dá)峰時間為0.5 h，在淡水中的峰濃度為910 μg/L，在鹽水中峰濃度明顯低于前者為760 μg/L。Tubbs等[11]報道，在給藥40 mg/kg的條件下，吡喹酮的峰濃度為12 730 μg/L(口灌溶液) 和10 620 μg/L(口灌藥物飼料混合物)。研究結(jié)果表明，給藥量的大小直接影響峰濃度，給與飼料混合物達(dá)峰時間會延遲。

在本研究中，口灌藥物飼料混合物吸收速率常數(shù)是口灌吡喹酮原藥的三分之一。這一現(xiàn)象表明飼料和藥物同時服用，影響了吡喹酮的吸收，使吸收速率常數(shù)變小。二者分布半衰期分別為0.4 h和1.2 h，同樣佐證了這一點(diǎn)。口灌藥物飼料混合物消除半衰期為8.6 h，顯著小于口灌原藥(18.1 h)。在Xie等[10]的報道中，消除半衰期較長，為71.2 h(淡水中)和56.5 h(鹽水中)。在無鰾石首魚的報道中明顯較短為6.6 h和7.9 h[11]。這個參數(shù)差異較大，可能與實驗溫度、魚類品種有較大的關(guān)系。在哺乳動物中，消除半衰期明顯短于魚類。例如在豬體中，靜注10 mg/kg吡喹酮時消除半衰期為1.5 h，口服50 mg/kg時為1.07 h[13]。在牛體中，靜注10 mg/kg時消除半衰期也明顯短于魚類，但在口服30 mg/kg時卻接近于本次研究[14]。魚類和哺乳動物之間的差異，可能是由于二者代謝酶的差異造成的。

口灌吡喹酮飼料混合物的生物利用度是34.7%，口灌吡喹酮原藥是47.0%，藥時曲線下面積相應(yīng)地降低了26.2%。吡喹酮生物利用的研究只在少數(shù)魚類體內(nèi)進(jìn)行過。在Tubbs等[11]研究中發(fā)現(xiàn)了一個奇怪的現(xiàn)象，口服吡喹酮與飼料的固體混合物，生物利用度反而超過了口服吡喹酮溶液。因此，混飼藥物的吸收、代謝和排泄，受到食物影響較大。目前在魚體中，飼料對藥物的藥動學(xué)影響研究報道較少，但是在人體和動物體已經(jīng)有了大量研究。目前研究表明，有許多食物吸收因素影響著藥物的吸收和代謝。例如四環(huán)素類藥物可以跟食物中的金屬離子相結(jié)合，形成不容易吸收的的離子絡(luò)合物[15]。另外，食物可以改變胃的排空率、胃腸道內(nèi)容物的pH值，腸道藥物代謝酶的活性，腸道血液循環(huán)的血流以及血漿蛋白結(jié)合律，從而促進(jìn)或降低藥物的吸收[16]。芬苯達(dá)唑和食物一起口服，芬苯達(dá)唑的系統(tǒng)生物利用度顯著增加[17]。服用甲苯咪唑的油懸液，其生物利用度也相應(yīng)增加[18]。對于抗高血壓和抗心律失常藥物，給與沒有禁食的患者，二者生物利用度也顯著增加，這是由于此類藥物改變了腸道血液循環(huán)血流速，藥物的吸收速率和藥物代謝酶的作用所導(dǎo)致的[19-21]。另外，有些藥物受食物的影響之后，生物利用度會降低，如β-內(nèi)酰胺類抗生素[22,23]、頭孢類抗生素[24]、紅霉素[25]和異煙肼[26]。這些藥物受胃排空率、腸道內(nèi)容物pH值和腸道血流速的影響較大。在本研究中吡喹酮受食物的影響后，生物利用度降低，可能是這些因素所導(dǎo)致。

本次研究表明口服和靜注吡喹酮之后，快速分布消除。口服吡喹酮和飼料混合物與口服吡喹酮原藥相比，生物利用度降低了12.3個百分點(diǎn)，其他藥動學(xué)參數(shù)沒有顯著的變化。這些數(shù)據(jù)的獲得將有利于吡喹酮的劑型改造和臨床方案的確定。