三氯生對雄性黃河鯉抗氧化和生長相關基因mRNA表達量的影響

王　凡，徐瑞杰，王　薇

(洛陽師范學院，河南洛陽 471022)

Keywords：triclosan;Cyprinuscarpio; antioxidant; growth

三氯生(triclosan，TCS)化學名稱為2，4，4-三氯-2-羥基-二苯醚，是一種羥二乙醚的三氯化衍生物[1]。作為一種廣譜抗菌劑，TCS具有低揮發性、高抗菌性、高耐熱性、耐酸堿性和易加工等特點，因此，其在洗漱用品、化妝用品、洗滌用品等個人生活用品中被廣泛應用[2，3]。隨著TCS的廣泛應用，在很多水體、沉積物、水生生物以及人類血漿、母乳中都能檢測到TCS的存在[4]。

TCS在污水處理廠不易被處理，因此污水處理廠的出水排放是TCS進入水環境的主要途徑，從而導致水生生物處于潛在的生態風險中。伍筱琳等[5]研究發現TCS明顯抑制小球藻光合色素含量的增加，影響其生長發育能力，表明TCS可在分子水平上產生毒性效應，影響酶和基因的正常表達及生理功能。陳建軍等[6]研究TCS對泥鰍可產生細胞毒性，損傷細胞以及組織，導致生物體組織器官產生畸變。TCS也可擾亂生物體的生殖系統、甲狀腺系統和神經系統正常的生理功能[7]。此外，在日常飲用水的消毒過程中，消毒液中的氯會與TCS發生反應生成氯仿和醚類等有毒物質，危害人體健康和生命安全[8]。TCS對硬骨魚類非特異性免疫及生長相關基因mRNA表達量影響的研究較少[9，10]。目前，已經監測到黃河受到不同程度TCS的污染[11]。本研究選用黃河鯉作為研究對象，研究TCS對雄性黃河鯉抗氧化酶及生長相關基因轉錄水平的影響，為全面探討TCS對魚類的免疫及生長調控機制奠定基礎，同時為科學合理監測TCS提供理論依據。

1　材料和方法

1.1　研究對象

黃河鯉(Cyprinuscarpio)，體長7.8～9.9 cm，購自河南省黃河鯉良種場，暫養在60 L水族箱中，暫養期間用水為曝氣3 d的去氯自來水，并用充氣泵向水族箱中持續增氧，水溫(18±3) ℃，溶氧>5 mg/L，pH值為7.0±0.2，按時投喂且及時清除殘餌和糞便。暫養7 d后開始進行正式的相關實驗。

1.2　試驗試劑

TCS(美國Sigma，>98.0%純度)、二甲基亞砜(天津紫明化工有限公司)、總RNA極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)、反轉錄試劑盒(日本東洋紡生物科技有限公司)、BestarSybrGreenqPCRmastermix(德國DBI公司)、引物序列(華大基因合成)、無菌水等。

1.3　實驗設計

根據相關報道[12]和前期實驗結果，得出鯉96 h的LC50為0.8 mg/L。在此基礎上，按照等對數間距設置了3個TCS處理組，依次為1/20 LC50(0.04 mg/L)、1/10 LC50(0.08 mg/L)和1/5 LC50(0.16 mg/L)，同時設置空白對照組，每組20條。為使TCS濃度基本維持相對恒定水平，每24 h換一半的染毒液，染毒時間為42 d，整個暴露實驗期間無魚死亡現象。

1.4　樣本的制備

暴露實驗進行42 d后從每實驗組中隨機選取5條雄性黃河鯉解剖并取其肝胰臟，然后分別迅速保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后期抗氧化酶及生長相關基因表達的檢測。

1.5　抗氧化及生長相關基因表達的檢測

1.5.1引物序列

β- actin、谷胱甘肽還原酶(GSR)、谷胱甘肽-S-轉移酶-A(GSTA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、促生長素(GH)和促生長因子(IGF1)基因的引物序來自相關報道[13,14]，詳見表1。

表1　實時熒光定量PCR所用基因的特異性引物及其序列Tab.1　Specific primers and its sequences used for real-time PCR

1.5.2RT-qPCR

RNA的提取按照極速RNA提取試劑盒中的詳細步驟進行操作，提取出來的RNA質量，用凝膠成像分析儀觀察并分析RNA提取結果，在此基礎上，并選取OD260/280為1.8～2.1的樣本用反轉錄試劑盒進行反轉錄，對反轉錄后的cDNA用實時熒光定量PCR試劑盒根據基因相應引物進行擴增定量，反應條件為：95 ℃預變性2 min；循環條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s同時檢測熒光信號，40個循環反應；融解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循環0.5 ℃/循環)86個循環。根據擴增曲線結果判斷目的基因和內參基因的擴增效率基本一致，然后利用2-ΔΔCt法進行計算相關基因的相對表達量。

1.6　數據分析

數據用SPSS Statistics 17.0軟件對實時熒光定量PCR結果進行分析，采用單因素方差分析法，數據用平均值±標準差表示，各個濃度組之間的差異采用Duncan法多重比較，當P<0.05時，表示對照組與處理組有顯著差異；當P<0.01時，表示對照組與處理組有極顯著差異。

2　結果與分析

2.1　三氯生對雄性黃河鯉肝胰臟抗氧化相關基因表達的影響

TCS對雄性黃河鯉肝胰臟抗氧化酶相關基因表達量的影響見圖1，結果顯示，與對照組(0 mg/L)相比，TCS各處理組肝胰臟中的GSR和GSTA mRNA相對表達量顯著下調，TCS濃度和mRNA的表達量之間不存在劑量效應關系。0.08 mg/L的 TCS 能使GPx mRNA表達量顯著下調，0.04及0.16 mg/L TCS處理組中GPx mRNA的表達量與對照組相比較無顯著差異。結果表明，TCS能夠降低雄性黃河鯉肝胰臟抗氧化酶相關基因mRNA表達量。

圖1　TCS對雄性黃河肝胰臟抗氧化酶相關基因mRNA表達的影響(A)谷胱甘肽還原酶(B)谷胱甘肽-S-轉移酶-A(C)谷胱甘肽過氧化物酶(n=5)Fig.1　Effect of TCS on expression of antioxidant enzyme related gene mRNA inhepatopancreas of male C.carpio(A) GSR(B) GSTA(C) GPx(n=5)“*”表示與0mg/L(空白對照)該基因表達量相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與0mg/L相比該基因表達量相比差異極顯著(P<0.01)

2.2　三氯生對雄性黃河鯉肝胰臟抗生長相關基因表達的影響

TCS對雄性黃河鯉肝胰臟生長相關基因表達量的影響見圖2，與對照組相比較，TCS各處理組肝胰臟GH轉錄水平極顯著下調，且依次下調了93.1%、47.7%和79.0%。而TCS使雄性黃河鯉肝胰臟中IGF1轉錄水平顯著性上調，且依次上調了263.3 %、100.2%和311.8%。結果表明，TCS顯著降低雄性黃河鯉肝胰臟促生長素mRNA表達量，而顯著增加促生長因子mRNA表達量。

3　討論

谷胱甘肽的變化與外源污染物的解毒機制相關，同時其氧化還原可以清除污染物暴露后產生的氧自由基[15，16]。谷胱甘肽相關的系列成份在生物體各器官中普遍存在，尤其在肝臟中含量居多。魚類谷胱甘肽相關的系列成分包括谷胱甘肽、GSR、GPx、GST[16]。GSR和GPx主要控制著還原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)之間的轉化。GSR在生物體組織中能夠催化GSSG與輔酶NADPH結合生成GSH。GPx是機體內廣泛存在的一種重要的抗氧化酶，特異催化GSH對過氧化氫的還原反應，對由活性氧和羥自由基誘發的過氧化物及過氧化氫有極強的清除能力，從而保護生物大分子和生物膜結構免受過氧化物的損傷。而GST是解毒系統第二階段的一種生物轉化酶，它同GPx一樣可以催化GSH轉化生成GSSG[17]。

圖2　TCS對雄性黃河肝胰臟生長相關基因mRNA表達量的影響(A)促生長素(B)促生長因子(n=5)Fig.2　Effect of TCS on expression of groth related gene mRNA inhepatopancreas of male C.carpio(A) GH(B) IGF1(n=5)“*”表示與0mg/L(空白對照)該基因表達量相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與0mg/L相比該基因表達量相比差異極顯著(P<0.01)

本研究中，各濃度組的TCS使黃河鯉肝胰臟中GSR和GSTA mRNA水平顯著下調。TCS暴露組肝胰臟GPx的表達量也均低于對照組，且TCS在0.08 mg/L時GPx的表達量被顯著抑制。上述結果可能是由于TCS或者其代謝物已進入魚體肝臟內產生了大量的自由基和過氧化物，這些自由基和過氧化物與GSH反應生成GSSG，GSH的過量消耗，超出了機體對GSH和GSSG之間轉化的調節范圍，從而導致GSR被顯著抑制。同時肝胰臟為了迅速解毒及清除過多的自由基和過氧化物，致使GPx和GSTA會進一步特異性催化GSH來保護機體受到的損傷，加速了GSH和GSSG之間不平衡關系，進而導致GPx和GSTA也被抑制。這與苯并芘和2,2′,4,4′,5-五溴聯苯醚暴露對哺乳類動物肝臟GSR影響[18，19]，氯化三丁基錫對黑鯛肝臟GPx的影響[20]，十溴聯苯醚對鯽肝胰臟GST影響[16]的結果相一致。但也有研究證實了TCS誘導了虹鱒和劍尾魚GST的mRNA水平[9，10]，十溴聯苯醚致使鯽肝胰臟GSR和GPx活性顯著升高，鎘誘導了黃顙魚肝臟中GSR和GPx活性[21]。上述結果的差異可能與物種的類別、污染物的濃度及暴露時間相關。總之，從本研究中TCS對黃河鯉肝胰臟的谷胱甘肽相關系列成分影響的結果分析可知，TCS對雄性黃河鯉肝胰臟的抗氧化系統產生了一定程度損傷。

GH 基因在動物個體早期發育過程中起著重要作用，與幼體出生后的生長和存活密切相關[22]，它通過與生長激素受體結合起作用。GH 的促生長發育作用除直接作用于靶細胞的生長激素受體外，主要是通過類胰島素生長因子(IGFs)介導而起作用，IGF1直接作用于骨骼、肌肉等靶器官，對動物胚胎及出生后的生長發育起著更為直接的作用。本研究中發現TCS使GH的mRNA表達量顯著降低，而對IGF1的mRNA表達量顯著升高，表明TCS干擾了雄性黃河鯉生長相關基因mRNA的表達，從而干擾了其正常生長的進程。