大型溞和金魚藻對三種微藻增殖的影響

姜小玉，楊佩昀，王潔玉，趙閃閃，褚一凡，馬劍敏

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉 453007)

近30年來，我國富營養化湖泊快速發展[1]，藻類水華頻繁發生。生態修復能夠在較長時間尺度上使水華的爆發得到有效的控制[2]，其研究重點主要集中在經典生物操縱法[3]和水生植物的恢復與重建[4]。生物操縱即通過對湖泊中生物和環境的一系列調節，促進其中的一些相互作用，使浮游植物生物量下降，投加浮游動物是生物操縱理論的實施途徑之一。浮游植物的生產力在水溞等枝角類浮游動物占優勢的湖泊中明顯較低[5-6]。因此，可以通過加入適量植食性枝角類浮游動物，使其達到并維持一定數量，抑制藻類的爆發式增殖，增加水體透明度[7]，減少富營養化現象的發生。現階段，國內外利用浮游動物的濾食作用控制水體富營養化取得成功的例子不在少數。Pogozhev等[8]研究得出長刺溞(Daphnialongispina)能夠有效減少銅綠微囊藻的生物量。張喜勤等[9]通過直接投放大型溞(D.magna)和方形網紋溞(Ceriodaphniaquadrangular)的方式治理長春南湖也獲得初步成功。水生植物作為水生生態系統的初級生產者，既能夠給浮游動物提供氧氣和較好的棲息環境，影響浮游動物的種類組成，使浮游植物的爆發式增殖得到有效抑制[10]，又能夠與浮游植物產生競爭抑制[11-12]，釋放化感物質抑制藻類的生長[13-14]。生物操縱和水生植物的恢復與重建同時實施，能夠有效抑制藻類增長。

本實驗室前期研究發現，在藻-溞-草的微宇宙構建系統中，小球藻[15]、銅綠微囊藻[16]、小環藻[17]單獨與大型溞、金魚藻共培養，大型溞及金魚藻的生物量均呈現上升趨勢，且有效抑制了藻類的增殖。由于自然水體中，各門藻類混合生長，本研究模擬自然水生態條件，把不同微藻混合培養，研究大型溞和金魚藻對其增殖的影響，便于找出藻類的競爭機理及水生動植物對浮游植物優勢種形成的影響，進而更好地控制藻類水華的發生，為富營養化水體的治理提供更多的理論參考。

1　材料與方法

1.1　培養液的配制

按D-1培養液[18]和BG-11培養液[19]各自成分的50%等比例混合配置B+D培養液(經預實驗篩選，適合所研究生物的生長)，調節pH值范圍為(7.0～9.0)，所有培養液和器皿均需高壓滅菌。

1.2　實驗材料

小環藻(Cyclotellasp.，FACHB-1654)、銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa，FACHB-573，不產毒)、小球藻(Chlorellavugaris)：購自中科院水生生物研究所，保存在B+D培養液中，置于恒溫培養箱(溫度25 ℃，光照度2 600-3 000 lx，光暗比14 h∶10 h)。

大型溞(D.magna)：采自新鄉市牧野湖，純化培養后，單獨培養馴化，培養條件同上，得到同一母體繁殖的、形態一致的幼齡大型溞用于實驗。

金魚藻(Ceratophyllumdemersum)：采自新鄉市牧野湖，用蒸餾水沖洗，去除表面泥沙和附著生物，培養于B+D培養液中，保證溫度適宜、陽光充裕。實驗時，選取生長較好、長勢一致的金魚藻頂枝，在蒸餾水中反復洗滌，用吸水紙吸干表面水分，稱取0.1 g用于實驗。

1.3　實驗方法

1.3.1接種方法

在對數生長期，分別取出適量經擴大培養的三種藻液，離心(3 500 r/min，10 min)后，棄上清液，用無菌蒸餾水洗滌2次，將沉淀的三種微藻分別接種到無氮磷的B+D培養液中，饑餓處理7 d，去除藻細胞中蓄積的氮磷。然后按上述方法離心懸浮3次，棄上清液，按實驗要求進行接種。均為無菌操作。

1.3.2小環藻、小球藻和銅綠微囊藻共培養

在250 mL的錐形瓶中加入200 mL B+D培養液，設三個平行，加入小環藻、小球藻和銅綠微囊藻各調節成1×105cells/mL的初始密度，置于恒溫光照培養箱內(溫度25 ℃，光照度2 600～3 000 lx，光暗比14 h∶10 h)，培養16 d，隔天加入適量培養液。每兩天測定藻細胞密度。

1.3.3大型溞與三種藻共培養

在1 L的錐形瓶中加入800 mL B+D培養液，設三個平行，加入小環藻、小球藻和銅綠微囊藻各調節成1×105cells/mL的初始密度，然后放入5只大型溞，置于恒溫光照培養箱內，培養16 d，隔天加入適量培養液。每兩天測定藻細胞密度，最后測定大型溞的數目。

1.3.4金魚藻與三種藻共培養

在1 L的錐形瓶中加入800 mL B+D培養液，設三個平行，加入小環藻、小球藻和銅綠微囊藻各調節成1×105cells/mL的初始密度，然后加入0.1 g金魚藻頂枝，置于恒溫光照培養箱內，培養16 d，隔天加入適量培養液。每兩天測定藻細胞密度，最后測定金魚藻的質量。

1.3.5大型溞和金魚藻與三種藻共培養

在1 L的錐形瓶中加入800 mL B+D培養液，設三個平行，加入小環藻、小球藻和銅綠微囊藻各調節成1×105cells/mL的初始密度，然后加入5只大型溞和0.1 g金魚藻頂枝，置于恒溫光照培養箱內，培養16 d，隔天加入適量培養液。每兩天測定藻細胞密度，最后測定大型溞的數目和金魚藻的質量。

待聞知太子橋來歷的游客走近細觀，所見也不過是兩塊年代久遠的長石板。其實看似簡陋的石橋不平凡，石板兩端的橋基是用干壘法構筑的石墩，精雕細鑿的石欄雖已蕩然無存，而橋面上碾出的兩道石槽般深深的車轍卻是歷史的記憶。可想而知，這座小石橋千百年來碾過了多少木轱轆的牛車、馬車、獨輪車。如今看似溝渠的窄窄一條堰河，當年應該是山谷里洶涌的溪澗，兩岸險峻的山道必是南來北往的商販和方圓百十里村莊鄉民上山下山必經之路。

1.4　測定指標

藻的細胞密度：每隔一天取10 mL樣品，搖勻取出0.1 μL，通過顯微鏡用XB-K-25型細胞計數板計數，計算藻細胞密度。

大型溞數量：肉眼計數。

金魚藻質量：用吸水紙吸干金魚藻表面水分，用電子天平稱重。

藻類增殖抑制率(I)=(1-D/D0)×100%

D和D0分別為處理組和對照組的藻細胞密度(×105cells/mL)，其中對照組是指三種藻共培養實驗，處理組是指溞-藻，草-藻和溞-草-藻共培養實驗。

1.5　數據處理

用Origin 8.5處理數據并制圖，用SPSS 19.0對不同實驗組的最大總藻細胞密度、同一實驗組不同藻類的最大細胞密度、不同實驗組同一藻類及同一實驗組的不同藻類的增殖抑制率進行方差分析。P<0.01表示差異極顯著。

2　結果與分析

2.1　三種藻共培養

在三種藻共培養的情況下，經過6 d，小環藻的細胞密度達到最大，為1.93×105cells/mL，之后逐步下降，于第16天完全死亡(圖1-a)。小球藻的細胞密度于第12天達到最大，為5.34×106cells/mL，之后逐步下降(圖1-b)。銅綠微囊藻在培養周期內持續增殖，到第16天最大細胞密度可達9.23×107cells/mL(圖1-c)，極顯著高于小環藻和小球藻的最大藻細胞密度，實驗末期占總藻細胞密度的95.95%，最終成為優勢種。三種藻共培養時，第16天最大總藻細胞密度可達9.62×107cells/mL(圖1-d)。

圖1　三種藻共培養時藻的細胞密度Fig.1　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algaea.小環藻；b.小球藻；c.銅綠微囊藻；d.總藻細胞密度

2.2　大型溞對三種藻增殖的影響

在大型溞和三種藻共培養的情況下，實驗結束后，大型溞平均存活45只，增長了8倍，實驗室已有研究發現，氮磷營養鹽充裕的條件下，大型溞和銅綠微囊藻共培養，大概增長30倍[15]。此實驗中大型溞沒有大量增殖，說明藻類抑制了大型溞的增長。如圖2，最大總藻細胞密度為6.5×106cells/mL，極顯著低于三藻共培養實驗，大型溞明顯抑制了三種藻的增殖。小環藻、小球藻和銅綠微囊藻的細胞密度分別于第6天、第12天、第8天達到最大值而后逐步下降，此時，其藻類增殖抑制率分別為29.10%、-18.56%和99.82%(見表1)。這說明大型溞顯著抑制了銅綠微囊藻的增殖(P<0.01)，削弱了銅綠微囊藻對其他兩種微藻的抑制，由于小環藻增殖速率緩慢，最終小球藻成為優勢種。

圖2　大型溞與三種藻共培養時藻的細胞密度Fig.2　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algae with D.magna

2.3　金魚藻對三種藻增殖的影響

圖3　金魚藻與三種藻共培養時藻的細胞密度Fig.3　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algae with C.demersum

2.4　大型溞和金魚藻對三種藻增殖的影響

在大型溞、金魚藻同時和三種藻共培養的情況下，大型溞平均存活283只，增長了55.6倍；金魚藻的平均重量為0.142 g，增長了42%，長勢良好。如圖4，最大總藻細胞密度為5.8×106cells/mL，極顯著低于三藻共培養實驗(P<0.01)，說明浮游動物和沉水植物共同作用可以顯著抑制藻類增殖。小環藻、小球藻和銅綠微囊藻的細胞密度分別于第4天、第10天和第8天達到最大值而后逐步下降，與2.1，2.2，2.3相比，提前進入衰減狀態。此時，其藻類增殖抑制率分別為36.02%、-5.46%和99.91%(見表1)。這說明大型溞和金魚藻聯合作用極顯著抑制了銅綠微囊藻的增殖(P<0.01)，削弱了銅綠微囊藻對其他微藻的競爭抑制，由于小環藻增殖速率緩慢，最終小球藻成為優勢種。

圖4　大型溞和金魚藻與三種藻共培養時藻的細胞密度Fig.4　Cell density of algae during the co-culture of three kinds of algae with D.magna and C.demersum

2.5　不同實驗組的增殖抑制率分析

如表1，單獨使用大型溞或金魚藻與三種藻共培養時，大型溞或金魚藻對銅綠微囊藻的增殖抑制率沒有顯著差異，金魚藻對小環藻和小球藻的增殖抑制率極顯著低于大型溞，說明大型溞抑藻效果更好。大型溞和金魚藻的聯合作用比金魚藻單獨作用更能極顯著抑制小環藻和小球藻的增殖，對銅綠微囊藻的抑制作用顯著高于其他實驗組，說明大型浮游動物和沉水植物的聯合作用能夠更好地抑制浮游藻類的增殖。在3組實驗處理中，小球藻的增殖抑制率皆為負值，表明與三藻共培養實驗相比，小球藻的最大細胞密度有所增加。因為無論加入大型溞，或金魚藻，或兩者同時加入，都會對銅綠微囊藻產生最大的抑制，削弱其對其他藻種的競爭抑制，改變三種藻之間的競爭態勢，更有利于小球藻的增殖。

表1　不同實驗組各微藻藻細胞密度最大時的增殖抑制率Tab.1　Growth inhibition rates of algae in the different experimental groups when the cell density was maximum (%)

注：平均值±標準誤差；不同大寫字母表示不同實驗組差異極顯著(P<0.01)

3　討論

3.1　小環藻、小球藻和銅綠微囊藻之間的相互競爭

小球藻和銅綠微囊藻細胞較小，直徑約為3～8 μm，增殖速率較快，而小環藻細胞相對較大，直徑約為10～30 μm，增殖速率最慢。三種藻共培養實驗中，藻類之間相互競爭，銅綠微囊藻增殖速率最快，占據絕對優勢，因為藍藻對營養[20]、光照[21]、空間、溫度的適應性更強，其二氧化碳濃縮機制也可以極大地降低細胞光呼吸速率，減少不必要的生物能量消耗，迅速適應生存條件的改變。此外，藍藻可通過合成與分解碳水化合物調控其在水中的浮力進而獲得適宜生長條件[22]，為形成優勢種提供便利。陳德輝等[23]通過微囊藻和柵藻競爭實驗證明了藍藻可以通過分泌有機化合物抑制其它藻的增殖。鑒于藍藻本身的各種競爭優勢，加之對其他藻種的增殖抑制，因此往往在藻種競爭中占據絕對優勢地位，有關報道與此研究結果相似[24-25]。不同水華微藻之間的拮抗作用，可以穩定富營養化水體中的藻種數目，影響藻類比例，有效防御及治理藻類爆發性增殖。

3.2　大型溞對三種藻的抑藻效果

實驗中的營養物質充足，生存條件適宜，但藻類生長不佳，大型溞明顯抑制了藻類的增殖。實驗結束時，總藻細胞密度6.5×106cells/mL，大型溞被抑制。研究發現[26]，當藻細胞密度較大時(超過4.11×106cells/mL)，大型溞的攝食速度、濾水速度和藻去除率都降低，大型溞對藻類的牧食速率小于藻類的增加速率，藻類快速繁殖，使培養液中原有的生態平衡被打破，導致大型溞的正常生長、發育、繁殖受到干擾，不利于大型溞的增殖。假設實驗仍然進行，藻類可能爆發性增殖，從而進一步惡化水質。

因為不同藻種的毒性、適口性、營養含量有所差異，大型溞對不同藻類的濾食率也參差不齊[27]。三種藻分開培養時，藻細胞分布均勻，都能夠被大型溞濾食。三種藻和大型溞共培養時，大型溞對銅綠微囊藻的抑制作用最為顯著，對其增殖抑制率顯著高于其他微藻，說明此時大型溞主要濾食銅綠微囊藻。銅綠微囊藻數量的急劇下降削弱了其對小環藻和小球藻的競爭抑制，由于小環藻生長速率緩慢，最終小球藻占優勢。與三種藻共培養的實驗相比，在與大型溞共培養實驗中，銅綠微囊藻的細胞密度顯著下降，優勢種由銅綠微囊藻轉換為小球藻，說明使用大型溞控制無毒的藍藻水華是可行的[27]。

3.3　金魚藻對三種藻的抑藻效果

苦草[28]、微齒眼子菜、穗狀狐尾藻[29]等諸類水生植物都可以抑制藻類的增殖。礦質營養、光照強弱、水生植物分泌的活性物質及其根際微生物的作用是水生植物抑制藻類增殖的主要原因。本實驗中，營養充裕，短時間內不干擾抑藻實驗，光照能從各角度直接進入到錐形瓶上，避免遮光狀況，所以可以排除營養和光照原因。故金魚藻能顯著抑制三種藻類的增殖可能是因為金魚藻能分泌抑藻物質，與Scheffer等[13]結果一致。

由于銅綠微囊藻被顯著抑制，小環藻生長速率緩慢，小球藻迅速增殖，最終發展成為優勢種，而三種藻共培養實驗中銅綠微囊藻占優勢，金魚藻對混合藻類的抑制作用可以導致優勢種的轉變，因為化感作用具有一定的選擇性，對不同藻類的抑制機理也不完全相同[30]。實驗結束后，金魚藻葉子只剩一半，不及初始質量，說明藻類的增殖可以在一定程度抑制金魚藻的生長，如果藻類繼續無節制地增殖，會使金魚藻全部死亡，進一步惡化水質。

3.4　大型溞和金魚藻對三種藻的抑藻效果

通過向培養液中單獨投加大型溞、金魚藻或二者同時加入，都可以對銅綠微囊藻產生最大的抑制，削弱其對小環藻和小球藻的競爭抑制，小球藻比三藻共培養實驗長得更好。因為三藻共培養時，小環藻增殖最慢，不管是否投加大型溞或金魚藻，實驗末期小環藻細胞密度都是最低的，單獨加入大型溞或同時加入大型溞和金魚藻，會進一步降低小環藻的細胞密度，但是影響不大。大型溞和金魚藻同時加入藻類培養液，在共培養實驗中抑藻效果最好。大型溞和金魚藻長勢良好，三種藻均得到了有效抑制。把大型溞等大型枝角類浮游動物投入富營養化水體中，主要是借助大型溞有效濾食浮游藻類和微小的有機顆粒物，另輔以水生植被的恢復與重建，為凈化水質營造良好的水生態基礎[31]。水生植物能夠與浮游藻類競爭各種生長資源，分泌化學活性物質抑制藻類增殖，還能為浮游動物輸送氧氣，提供棲息地等，間接對藻類增殖起到控制作用。所以，生物操縱和水生植物的恢復與重建相輔相成，可長期穩定改善水質。Blindow等[32]也提出，應在生物操縱之后實施水生植被的恢復與重建，這樣才能保證湖泊生態系統的正常功能。

生物操縱和水生植被的恢復與重建相結合，可以控制藻類爆發性增殖，減少水華發生的概率，凈化水質，更有利于生態修復技術控藻的有效性與長期性。但是實驗室模擬自然水生態條件下所得結果僅為理論參考，若投入正式實踐還需結合野外水體做進一步研究。

4　結論

用B+D培養液，在溫度25 ℃、光照度2 600～3 000 lx、光暗比14 h∶10 h的條件下，當小環藻、小球藻和銅綠微囊藻共培養時，銅綠微囊藻在競爭中占絕對優勢，成為優勢種；當大型溞或金魚藻其一與三種藻共培養時，均對三種藻(尤其對銅綠微囊藻)的增殖有明顯的抑制作用，最終小球藻占優勢，大型溞的抑制效果好于金魚藻；當大型溞和金魚藻與三種藻共培養時，對三種藻的抑制效果達到最大。